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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 跪求大神设计引物，我是做原核表达的，之前设计的都是引物二聚体，没有扩出来
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小?求大神

新虫 (初入文坛)

[求助] 跪求大神设计引物，我是做原核表达的，之前设计的都是引物二聚体，没有扩出来

ATGCAGGATTCTGGAATCGAGTTTGATATAGCTTCACTTGCCGACGCAGATCAAGTTTTAAACGATGACAAAAATTTTTACCAGCTGAAAAGTAAAACGATCGTTCAAAGCCAAAGCAACAACATGACAAAACTAGACGTCTCAAAGGGAAACCTGCGAGCGAACCTCCGCCTCCAGCTGATGCGTTTGCAGACGGAACAGGAGGAGAAAAAGAACGAGCAGACACCATCCTACTCCCAGTCCTACCGGCCAGCTCATACCGCTCCTCAGTCGATCCAGATACCGGCGGGCTCCGTTAGCTCCAGTACAGAGGTCCCTACACGAGTTCTTACAGTGAAGACTCAGCTAGAAAACCCAACACAGTTCCATGTGACTGAGAACCAGAAGCGACAGATTCACCTGTTCCTGCACAACTCTGGTAAGGTGACCACCGCCCAGTCTATGCCTGCCCTCACCACACAGATCCCTGGGGCCAATATGGTGCCCACTACGGTCAGTGGCAGCGCCCCCGTGGACCCGGACAGCCCGCTCTCCATGGGACTCAGCAGTGCCACTAACAGTGTCTCAGATTTCAATGAGGTGGATAACCTTTTGAATGACCTCATCAGCTTGGAGTCAGTGGATCCTAATGTAGACCAGGATCTTAATCTGTTGGAACCCTCCCTCAACCACATGTCCACAACACTTCCCCATTCAAACAACATCCTTGGTCTGTACGACACAAACGATGATGCATCGAATGGAGCCAGCTCCTGCCCCGCCAAGTTTCAGGCGGGGGAACTGAGGCTGCCAGAGTTCATGTCTGAGGAGGAAAAGAGAATGTGGGCAAAGGACCGACAGAAGAAAGACAACCATAACATGATTGAGAGAAGAAGAAGATTCAACATAAACGACAGAATCAAAGAACTTGGCACTCTCCTCCCAAAGAGCACCGACCCTGACATGAGACAGAACAAGGGAACGATCCTGAAGGCCTCAGTGGAGTACATCCGCCGGCTGAAGAAGGACCAGGACCGGATGAAGCTGATGGAGACCCGCCAGAGACAGCTGGAGATGAACAACAGGAAGCTGCTCCTCAGAATGCAGCAAATGGAGTTGGTCATGAAATCTCAAGGAATGGGAACTGGTCTTGACAATGAAATAGAACAACTGACACTCACCCAGCAACCAGCCCCCTTTCAGGCCGCCAAATTCCAGCCTGATCTAACTCAAACCAATGTTTTCGTGAACCATGCTAACATCATGGATGAGTTCATGGATGACAGTTCTCCCGTGAACGCGGACCCTATGCTGTCGTCTGAGCCCGTGAGTCCCAGTAACCTGGACGATTCATCAGACATGTTATGA
这是ORF，包括启动和终止密码子，没有信号肽，求大神帮助，比较急????

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1楼 2018-05-08 13:54:15
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小?求大神

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 小?求大神 at 2018-05-08 13:54:15
ATGCAGGATTCTGGAATCGAGTTTGATATAGCTTCACTTGCCGACGCAGATCAAGTTTTAAACGATGACAAAAATTTTTACCAGCTGAAAAGTAAAACGATCGTTCAAAGCCAAAGCAACAACATGACAAAACTAGACGTCTCAAAGGGAAACCTGCGAGCGAACCTCCGCCTCCAGCTGATGCGTTTGCAGACGGAAC ...

我做的是原核表达

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2楼2018-05-08 13:56:30
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
你原来设计的什么引物？

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3楼2018-05-08 14:07:56
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小?求大神

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-05-08 14:07:56
你原来设计的什么引物？

也是做原核表达的引物，就是扩出ORF.加酶切位点的pcr引物，但是跑出来只有引物二聚体

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4楼2018-05-08 14:30:39
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小?求大神 at 2018-05-08 14:30:39
也是做原核表达的引物，就是扩出ORF.加酶切位点的pcr引物，但是跑出来只有引物二聚体
...

我是说把你原来设计的引物po上来看看
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5楼2018-05-08 15:12:54
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昕语星愿

新虫 (初入文坛)
克隆不出来也不一定是引物的问题呀，再说你这个好像也只能从ATG往前面卡

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6楼2018-05-08 17:11:21
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-05-09 07:58:29
可能不是引物的问题，用的是cDNA模板还是质粒模板？普通的酶还是专门扩增高GC含量的酶？从你这段序列来看，里面的C含量貌似很高，如果是普通的taq酶，试试换高GCtaq酶。
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。
7楼2018-05-08 21:26:02
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小?求大神

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2018-05-08 21:26:02
可能不是引物的问题，用的是cDNA模板还是质粒模板？普通的酶还是专门扩增高GC含量的酶？从你这段序列来看，里面的C含量貌似很高，如果是普通的taq酶，试试换高GCtaq酶。

cDNA模板。是r Taq酶

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8楼2018-05-08 23:49:37
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-05-09 07:58:45
重新设计一对引物，不要加没切位点，扩增出来做TA克隆，测序后提取质粒做模板，再用加了酶切位点的引物扩增。扩增不出来的原因有很多，一是你扩增的这个基因在RNA样本中表达丰度不高，二是引物过长，三是cDNA反转录质量不好。
我的建议是，已有的cDNA跑一下actin引物，看下转录效果，效果不好重新反转录。如果cDNA模板质量不错，那就要考虑扩增基因的表达丰度问题，你的cDNA转录来自某一个组织样本的RNA还是总RNA，如果是前者，那就提一次不同组织的混合RNA，重新反转录。前面两个问题排除后，就是模板的GC含量问题了，试试高GCbuffer的taq酶，takara也有卖。实验就是玄学，你只能一个个问题排查，没有办法。
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9楼2018-05-09 02:20:47
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