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小?求大神

新虫 (初入文坛)

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[求助] 跪求大神设计引物，我是做原核表达的，之前设计的都是引物二聚体，没有扩出来

ATGCAGGATTCTGGAATCGAGTTTGATATAGCTTCACTTGCCGACGCAGATCAAGTTTTAAACGATGACAAAAATTTTTACCAGCTGAAAAGTAAAACGATCGTTCAAAGCCAAAGCAACAACATGACAAAACTAGACGTCTCAAAGGGAAACCTGCGAGCGAACCTCCGCCTCCAGCTGATGCGTTTGCAGACGGAACAGGAGGAGAAAAAGAACGAGCAGACACCATCCTACTCCCAGTCCTACCGGCCAGCTCATACCGCTCCTCAGTCGATCCAGATACCGGCGGGCTCCGTTAGCTCCAGTACAGAGGTCCCTACACGAGTTCTTACAGTGAAGACTCAGCTAGAAAACCCAACACAGTTCCATGTGACTGAGAACCAGAAGCGACAGATTCACCTGTTCCTGCACAACTCTGGTAAGGTGACCACCGCCCAGTCTATGCCTGCCCTCACCACACAGATCCCTGGGGCCAATATGGTGCCCACTACGGTCAGTGGCAGCGCCCCCGTGGACCCGGACAGCCCGCTCTCCATGGGACTCAGCAGTGCCACTAACAGTGTCTCAGATTTCAATGAGGTGGATAACCTTTTGAATGACCTCATCAGCTTGGAGTCAGTGGATCCTAATGTAGACCAGGATCTTAATCTGTTGGAACCCTCCCTCAACCACATGTCCACAACACTTCCCCATTCAAACAACATCCTTGGTCTGTACGACACAAACGATGATGCATCGAATGGAGCCAGCTCCTGCCCCGCCAAGTTTCAGGCGGGGGAACTGAGGCTGCCAGAGTTCATGTCTGAGGAGGAAAAGAGAATGTGGGCAAAGGACCGACAGAAGAAAGACAACCATAACATGATTGAGAGAAGAAGAAGATTCAACATAAACGACAGAATCAAAGAACTTGGCACTCTCCTCCCAAAGAGCACCGACCCTGACATGAGACAGAACAAGGGAACGATCCTGAAGGCCTCAGTGGAGTACATCCGCCGGCTGAAGAAGGACCAGGACCGGATGAAGCTGATGGAGACCCGCCAGAGACAGCTGGAGATGAACAACAGGAAGCTGCTCCTCAGAATGCAGCAAATGGAGTTGGTCATGAAATCTCAAGGAATGGGAACTGGTCTTGACAATGAAATAGAACAACTGACACTCACCCAGCAACCAGCCCCCTTTCAGGCCGCCAAATTCCAGCCTGATCTAACTCAAACCAATGTTTTCGTGAACCATGCTAACATCATGGATGAGTTCATGGATGACAGTTCTCCCGTGAACGCGGACCCTATGCTGTCGTCTGAGCCCGTGAGTCCCAGTAACCTGGACGATTCATCAGACATGTTATGA
这是ORF，包括启动和终止密码子，没有信号肽，求大神帮助，比较急????

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1楼 2018-05-08 13:54:15

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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

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★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-05-09 07:58:45

重新设计一对引物，不要加没切位点，扩增出来做TA克隆，测序后提取质粒做模板，再用加了酶切位点的引物扩增。扩增不出来的原因有很多，一是你扩增的这个基因在RNA样本中表达丰度不高，二是引物过长，三是cDNA反转录质量不好。
我的建议是，已有的cDNA跑一下actin引物，看下转录效果，效果不好重新反转录。如果cDNA模板质量不错，那就要考虑扩增基因的表达丰度问题，你的cDNA转录来自某一个组织样本的RNA还是总RNA，如果是前者，那就提一次不同组织的混合RNA，重新反转录。前面两个问题排除后，就是模板的GC含量问题了，试试高GCbuffer的taq酶，takara也有卖。实验就是玄学，你只能一个个问题排查，没有办法。

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。

9楼2018-05-09 02:20:47

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小?求大神

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引用回帖:

1楼: Originally posted by 小?求大神 at 2018-05-08 13:54:15
ATGCAGGATTCTGGAATCGAGTTTGATATAGCTTCACTTGCCGACGCAGATCAAGTTTTAAACGATGACAAAAATTTTTACCAGCTGAAAAGTAAAACGATCGTTCAAAGCCAAAGCAACAACATGACAAAACTAGACGTCTCAAAGGGAAACCTGCGAGCGAACCTCCGCCTCCAGCTGATGCGTTTGCAGACGGAAC ...

我做的是原核表达

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2楼2018-05-08 13:56:30

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