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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒转化农杆菌EHA105检测问题
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一路向北007

木虫 (著名写手)

[求助] 质粒转化农杆菌EHA105检测问题 已有1人参与

各位大侠，本人最近构建表达载体（pCambia）总是出这样的问题：自己构建的克隆载体经质粒PCR检测并经过测序，均没有问题。随后将表达载体通过电击转化和冻融转化的方法转化农杆菌EHA105。28度培养箱培养约48小时，平板上都长了单克隆，但是，（1）挑斑后摇菌有的摇不到浑浊（金黄色），仍然是澄清；（2）挑斑后摇菌终于有的摇到浑浊（金黄色），菌液PCR确检测不到目的基因或者是条带极弱。
实在是不知道是哪里出了问题，急求大侠帮忙分析一下，不胜感激！
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我就是我。
1楼 2018-04-09 22:17:02
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一路向北007

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zjx891211 at 2018-04-09 23:48:38
摇不起来的应该就是假阳性，摇起来p不出来的情况很多见，农杆菌多糖含量较高，taq酶结合位点可能被糖蛋白包裹以致于taq酶结合不上去没法扩增，解决办法提个质粒，一般能提出质粒基本就是了，不过还得进一步检验，手 ...

谢谢你的回复！
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我就是我。
6楼2018-04-18 00:34:37
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zjx891211

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-04-18 07:57:25
摇不起来的应该就是假阳性，摇起来p不出来的情况很多见，农杆菌多糖含量较高，taq酶结合位点可能被糖蛋白包裹以致于taq酶结合不上去没法扩增，解决办法提个质粒，一般能提出质粒基本就是了，不过还得进一步检验，手提质粒的话多糖蛋白去除比较干净，因此酶切或是pcr鉴定都可以，推荐酶切，pcr假阳性概率高。试剂盒提质粒的话酶切不是特别好用，可能切不开，pcr可用但还是假阳性概率问题

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2楼2018-04-09 23:48:38
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pjxiongjing

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zjx891211 at 2018-04-09 23:48:38
摇不起来的应该就是假阳性，摇起来p不出来的情况很多见，农杆菌多糖含量较高，taq酶结合位点可能被糖蛋白包裹以致于taq酶结合不上去没法扩增，解决办法提个质粒，一般能提出质粒基本就是了，不过还得进一步检验，手 ...

大肠杆菌菌液检测弱，提质粒检测能扩增出条带，酶切测序都对，转农杆菌长得少，扩增条带弱，还是保存半年后活化，有菌生长，但PCR扩增不出来

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3楼2018-04-10 00:17:36
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Neo2000

木虫 (著名写手)
很有可能是养菌的问题，重新配培养基和抗生素试试

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4楼2018-04-10 14:07:04
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