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rrrhm

新虫 (初入文坛)

[求助] 5'粘性末端的片段加A尾,做TA克隆已有2人参与

最近拿有一个天然质粒,用三种酶随机切,切了之后跑胶确定被酶切成了不同的片段。之后要做TA克隆,想给片段加A尾。因为我用的酶切出来之后都是带有5'突出末端,所以想知道,要是加A尾的话,是不是直接用TAQ酶加A尾就行了呢?
因为taq酶具有5'-3'的聚合酶活性,可以将5'粘性末端补平,最后在3'端加A尾,不知道这样行不行?
另外,想问一问,在做TA克隆转化步骤中,酶切灭活后,加A尾时需要纯化酶切片段吗?加了A尾之后也需要纯化片段吗?
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rrrhm

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-01-15 12:30:58
首先,Taq酶可以加尾,其次,加尾后用PCR纯化试剂盒纯化就行,不用切胶回收

你好,请问,我酶切后跑胶确认片段切开了,80℃灭活5min,这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗?还是说灭活体系直接加TAQ酶对加A尾没有影响呢?
4楼2018-01-15 12:59:26
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
rrrhm: 金币+2, ★★★很有帮助 2018-01-15 13:08:42
首先,Taq酶可以加尾,其次,加尾后用PCR纯化试剂盒纯化就行,不用切胶回收

发自小木虫Android客户端
2楼2018-01-15 12:30:58
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
rrrhm: 金币+3, ★★★很有帮助 2018-01-15 13:13:41
1. taq酶可以补平加A
2, 需要纯化,主要是去掉taqbuffer,换成连接酶buffer
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-01-15 12:47:25
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rrrhm

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-15 12:47:25
1. taq酶可以补平加A
2, 需要纯化,主要是去掉taqbuffer,换成连接酶buffer

你好,请问,我酶切后跑胶确认片段切开了,80℃灭活5min,这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗?直接加TAQ酶对加A尾有影响吗?
另外,加A尾这个步骤还需要94℃2min来预变性吗?还是只用72℃ 10min就好呢?
5楼2018-01-15 13:13:27
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