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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 5'粘性末端的片段加A尾，做TA克隆
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rrrhm

新虫 (初入文坛)

[求助] 5'粘性末端的片段加A尾，做TA克隆已有2人参与

最近拿有一个天然质粒，用三种酶随机切，切了之后跑胶确定被酶切成了不同的片段。之后要做TA克隆，想给片段加A尾。因为我用的酶切出来之后都是带有5'突出末端，所以想知道，要是加A尾的话，是不是直接用TAQ酶加A尾就行了呢？
因为taq酶具有5'-3'的聚合酶活性，可以将5'粘性末端补平，最后在3'端加A尾，不知道这样行不行？
另外，想问一问，在做TA克隆转化步骤中，酶切灭活后，加A尾时需要纯化酶切片段吗？加了A尾之后也需要纯化片段吗？
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1楼2018-01-15 12:10:02
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
rrrhm: 金币+2, ★★★很有帮助 2018-01-15 13:08:42
首先，Taq酶可以加尾，其次，加尾后用PCR纯化试剂盒纯化就行，不用切胶回收

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2楼2018-01-15 12:30:58
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
rrrhm: 金币+3, ★★★很有帮助 2018-01-15 13:13:41
1. taq酶可以补平加A
2， 需要纯化，主要是去掉taqbuffer，换成连接酶buffer
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-01-15 12:47:25
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rrrhm

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-01-15 12:30:58
首先，Taq酶可以加尾，其次，加尾后用PCR纯化试剂盒纯化就行，不用切胶回收

你好，请问，我酶切后跑胶确认片段切开了，80℃灭活5min，这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗？还是说灭活体系直接加TAQ酶对加A尾没有影响呢？
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4楼2018-01-15 12:59:26
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rrrhm

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-15 12:47:25
1. taq酶可以补平加A
2， 需要纯化，主要是去掉taqbuffer，换成连接酶buffer

你好，请问，我酶切后跑胶确认片段切开了，80℃灭活5min，这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗？直接加TAQ酶对加A尾有影响吗？
另外，加A尾这个步骤还需要94℃2min来预变性吗？还是只用72℃ 10min就好呢？
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5楼2018-01-15 13:13:27
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by rrrhm at 2018-01-15 13:13:27
你好，请问，我酶切后跑胶确认片段切开了，80℃灭活5min，这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗？直接加TAQ酶对加A尾有影响吗？
另外，加A尾这个步骤还需要94℃2min来预变性吗？还是只用72℃ 10min就好呢？...

酶切后你要分离出自己要的片段吧？而且buffer不同，所以最好纯化。直接加taq可能没活性
不需要变形，72˚C10min-30min。
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
6楼2018-01-15 13:22:04
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