应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 5'粘性末端的片段加A尾，做TA克隆
31/1返回列表
查看: 3669  |  回复: 5
查看全部回帖@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

rrrhm

新虫 (初入文坛)

[求助] 5'粘性末端的片段加A尾，做TA克隆已有2人参与

最近拿有一个天然质粒，用三种酶随机切，切了之后跑胶确定被酶切成了不同的片段。之后要做TA克隆，想给片段加A尾。因为我用的酶切出来之后都是带有5'突出末端，所以想知道，要是加A尾的话，是不是直接用TAQ酶加A尾就行了呢？
因为taq酶具有5'-3'的聚合酶活性，可以将5'粘性末端补平，最后在3'端加A尾，不知道这样行不行？
另外，想问一问，在做TA克隆转化步骤中，酶切灭活后，加A尾时需要纯化酶切片段吗？加了A尾之后也需要纯化片段吗？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼2018-01-15 12:10:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
rrrhm: 金币+3, ★★★很有帮助 2018-01-15 13:13:41
1. taq酶可以补平加A
2， 需要纯化，主要是去掉taqbuffer，换成连接酶buffer
赞一下(1人) 回复此楼
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-01-15 12:47:25
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by rrrhm at 2018-01-15 13:13:27
你好，请问，我酶切后跑胶确认片段切开了，80℃灭活5min，这个体系需要纯化了再加TAQ酶吗？直接加TAQ酶对加A尾有影响吗？
另外，加A尾这个步骤还需要94℃2min来预变性吗？还是只用72℃ 10min就好呢？...

酶切后你要分离出自己要的片段吧？而且buffer不同，所以最好纯化。直接加taq可能没活性
不需要变形，72˚C10min-30min。
赞一下(2人) 回复此楼
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
6楼2018-01-15 13:22:04
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 rrrhm 的主题更新
31/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 论文翻译-EnPapers美助理教授团队-SCI英文润色
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 2025年博士申请，可先做科研助理 +3 limit888 2024-06-18 6/300 2024-06-20 02:43 by limit888
[硕博家园] 豫北虫友互识 +10 xuhongli903 2024-06-18 11/550 2024-06-20 00:25 by xuhongli903
[找工作] 高校两个offer选择 +13 cowox2021 2024-06-18 14/700 2024-06-19 23:04 by feng6531
[考博] 关于读博感觉自己很抓马 +8 小九月 2024-06-19 11/550 2024-06-19 19:22 by 鱼翔浅底1
[精细化工] 切削液交流群 +3 SZ吴彦祖 2024-06-17 3/150 2024-06-19 14:31 by herng2021
[教师之家] 试用期辞职 +9 ZHONGWU_U 2024-06-18 14/700 2024-06-19 12:36 by ZHONGWU_U
[论文投稿] ACS AMI 返回审稿意见，一个大修，两个据稿，编辑给的修改重投 +5 智商已更新 2024-06-19 5/250 2024-06-19 12:35 by nono2009
[论文投稿] 审稿人含糊拒稿，还需要回复吗？如何回复？ 20+4 BruceChum 2024-06-15 22/1100 2024-06-19 08:00 by kanyechris
[精细化工] 试剂价格 +4 旭必上岸 2024-06-17 4/200 2024-06-18 23:58 by 又幂青松顶
[找工作] 杭电、天津科技、青农和宁波工程学院如何选？ +12 味道很好啊 2024-06-13 24/1200 2024-06-18 23:09 by 药材
[教师之家] 请问事业编制和年薪制冲突吗？ +12 ZHONGWU_U 2024-06-14 12/600 2024-06-18 19:31 by fangyl2005
[高分子] 寻找聚酯反应釜 +3 茕茕恭煮 2024-06-15 6/300 2024-06-18 14:15 by 茕茕恭煮
[高分子] 烧瓶内合成聚酯 +3 大帝国乐 2024-06-17 7/350 2024-06-18 11:10 by 大帝国乐
[硕博家园] 博士毕业高校和就业的相关问题 +7 SCITOPPP 2024-06-14 11/550 2024-06-18 07:51 by yinxing1995
[教师之家] 每次骚扰女学生的都是院系领导，而不是普通教师，小编们要注意措辞正确 +9 zju2000 2024-06-15 11/550 2024-06-16 14:49 by appleapple2
[论文投稿] 投稿时忘记修改一作 +7 gll123456 2024-06-13 11/550 2024-06-15 11:49 by gll123456
[基金申请] 博后基金，以往的结果点不开，怎么回事呢？最后一次机会了，两次都没中前面。 +7 kyukitu 2024-06-14 13/650 2024-06-15 06:46 by 我是王小帅
[论文投稿] 投了一篇4区的SCI，审稿人一个拒稿，一个小修，编辑给了大修。 +9 安稳22123 2024-06-13 10/500 2024-06-14 23:45 by jurkat.1640
[基金申请] E12面上申请 +4 汉风之遗 2024-06-13 4/200 2024-06-14 15:28 by 天外飞去来
[基金申请] 工材E10口函评结束了吗 10+3 我1的飞翔 2024-06-13 5/250 2024-06-14 06:35 by nono2009
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭