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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助前辈，有做过绿色荧光蛋白融合表达的吗
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mjl3680

木虫 (小有名气)

[交流] 求助前辈，有做过绿色荧光蛋白融合表达的吗

我是将一个疏水蛋白和绿色荧光蛋白融合表达，IPTG诱导后能看到菌体有绿色荧光，但全细胞跑SDS-PAGE，看不出表达蛋白的条带，不知道能看到绿色荧光是否说明这个融合表达的蛋白是可溶的，电泳检测不到，除了做WESTERN，还有什么别的方便办法，或者有谁做过原核表达的，给些建议，我的载体是PET30a+,宿主是BL21大肠杆菌。
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1楼 2009-03-03 21:59:26
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36678293

铜虫 (正式写手)
需要帮助吗，可以联系QQ:36678293,最低的价格，低的让你满意为止！
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2楼2009-03-04 00:27:36
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jasco

木虫 (正式写手)
能看到荧光是说明gfp有表达，但不能说明是可溶的，你全菌sdspage看不到表达条带可能是表达量很低，我觉得先试试看能不能提高表达量，比如低温诱导过夜之类的方法。能做WB当然是最好的啦。
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3楼2009-03-04 10:23:47
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
除了Western Blot以外，你还可以全菌包被做ELISA，但是除了免疫学检测的方法以外，应该没有什么很好的办法。除非你的蛋白有特殊的功能或者催化能力，你用相应的手段可以测出来，比如酶活等。有荧光的话应该是有所表达的，但是并不能绝对确定是融合蛋白的准确表达。还是做一做免疫学实验鉴定一下吧。还要看你纯化这个蛋白要做什么，有很多实验并不需要很多蛋白的。
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For my life！
4楼2009-03-04 15:38:35
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
还有，刚才忘了说，你应该检测一下是否有包涵体，就是将菌体超声破碎，10000G以上离心，比较离心前后的跑胶接过，看是否减少。离心后取上清。
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For my life！
5楼2009-03-04 15:46:51
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bbyu007

木虫 (正式写手)
用基因枪转化，看GFP也不错！试试吧
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我是笨笨鱼~~~
6楼2009-03-04 16:44:52
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mjl3680

木虫 (小有名气)
我也是想通过提高表达量，先用电泳大致看一下表达蛋白的大小，低温，诱导时间加长，表达量增加，是从菌体沉淀发绿色看出来，但泡电泳不理想，因有组氨酸标签，过Ni柱结果也不好，不过我都是按可溶表达来处理。
  接下来我看看包涵体吧，大家对用NI柱纯化有什么经验可以教教我吗？
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7楼2009-03-06 17:49:57
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