24小时热门版块排行榜    

查看: 723  |  回复: 6
当前主题已经存档。

mjl3680

木虫 (小有名气)

[交流] 求助前辈,有做过绿色荧光蛋白融合表达的吗

我是将一个疏水蛋白和绿色荧光蛋白融合表达,IPTG诱导后能看到菌体有绿色荧光,但全细胞跑SDS-PAGE,看不出表达蛋白的条带,不知道能看到绿色荧光是否说明这个融合表达的蛋白是可溶的,电泳检测不到,除了做WESTERN,还有什么别的方便办法,或者有谁做过原核表达的,给些建议,我的载体是PET30a+,宿主是BL21大肠杆菌。
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

36678293

铜虫 (正式写手)

需要帮助吗,可以联系QQ:36678293,最低的价格,低的让你满意为止!
2楼2009-03-04 00:27:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)

能看到荧光是说明gfp有表达,但不能说明是可溶的,你全菌sdspage看不到表达条带可能是表达量很低,我觉得先试试看能不能提高表达量,比如低温诱导过夜之类的方法。能做WB当然是最好的啦。
3楼2009-03-04 10:23:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客

除了Western Blot以外,你还可以全菌包被做ELISA,但是除了免疫学检测的方法以外,应该没有什么很好的办法。除非你的蛋白有特殊的功能或者催化能力,你用相应的手段可以测出来,比如酶活等。有荧光的话应该是有所表达的,但是并不能绝对确定是融合蛋白的准确表达。还是做一做免疫学实验鉴定一下吧。还要看你纯化这个蛋白要做什么,有很多实验并不需要很多蛋白的。
For my life!
4楼2009-03-04 15:38:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客

还有,刚才忘了说,你应该检测一下是否有包涵体,就是将菌体超声破碎,10000G以上离心,比较离心前后的跑胶接过,看是否减少。离心后取上清。
For my life!
5楼2009-03-04 15:46:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bbyu007

木虫 (正式写手)

用基因枪转化,看GFP也不错!试试吧
我是笨笨鱼~~~
6楼2009-03-04 16:44:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mjl3680

木虫 (小有名气)

我也是想通过提高表达量,先用电泳大致看一下表达蛋白的大小,低温,诱导时间加长,表达量增加,是从菌体沉淀发绿色看出来,但泡电泳不理想,因有组氨酸标签,过Ni柱结果也不好,不过我都是按可溶表达来处理。
  接下来我看看包涵体吧,大家对用NI柱纯化有什么经验可以教教我吗?
7楼2009-03-06 17:49:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 mjl3680 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 时间戳变了,能看出什么问题? +8 基诺咪客 2026-08-17 11/550 2026-08-18 17:13 by 悠然熊猫
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +50 医学老男孩 2026-08-13 109/5450 2026-08-18 16:56 by 医学老男孩
[基金申请] 重要消息,中午系统在维护 +9 yuleib84 2026-08-18 10/500 2026-08-18 16:52 by archvillain
[教师之家] 两姐妹,一个辛辛苦苦30岁工作当大学教师,另一个23岁就工作当开车教练 +3 瞬息宇宙 2026-08-11 7/350 2026-08-18 16:42 by LNP@mRNA
[基金申请] 明天放榜? +4 Shxjjxjkx 2026-08-18 4/200 2026-08-18 15:59 by abcabc1133
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜? +13 Ldrop2023 2026-08-13 16/800 2026-08-18 12:25 by 淀粉搬运工
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 8/400 2026-08-18 11:47 by gltch
[基金申请] 快农历七夕节了,轻松一下,男人悄悄话,女施主请不要进来。 +4 Tide man 2026-08-14 5/250 2026-08-18 11:35 by Tide man
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +8 wangze12014 2026-08-14 10/500 2026-08-17 17:05 by xter9665
[基金申请] 今天系统多次维护,明天很可能放榜! +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 各位道友,我要去昆明玩几天,回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 重要来源:本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了,巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 结合人工智能,周易传统文化,filecode打分制来了,3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
信息提示
请填处理意见