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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)


已领完
overlap PCR一直连接不上去
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我分段扩增一个基因的ORF,第一段1400bp,第二段1100bp,分段都扩增出来了(重叠区23bp),但是连不上去呀。
我的体系如下:
第一段、第二段切胶回收纯化后产物各20ng、
taq酶,dNTP,水至48微升。
PCR循环退火54℃,72℃延伸2min30s,5个循环。
加入全长正反引物各1微升,继续普通pcr,35个循环。
跑胶出来在2k以上没有条带,反而1k左右大面积亮带。

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莫落

木虫 (正式写手)



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都是1K左右的,说明两个片段绝大部分没有连接上,单个引物把两个小片段单独扩出来了;有以下建议:

1. 回收的片段确实有点低,可以进行PCR加大片段的量,毕竟两个片段都有1K以上了;
2. 开始重叠的PCR循环数可以加多,5个循环实在太少;
3. 如果愿意重新设计引物的话,可以适当增长重叠区域。
14楼2017-12-13 13:34:00
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)


我猜测可能的几个原因:①回收的浓度太低,第二个片段只有7ng/微升,可能不是我的DNA,②退火温度太低,我看别人的退火温度都在60℃左右,③overlap的退火和延伸时间不够,我的退火30s,延伸2min30s

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11楼2017-12-13 01:25:44
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)


13楼2017-12-13 09:30:01
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理工学霸

金虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
可以试试同源重组

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15楼2017-12-18 08:25:18
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hbabc2楼
2017-12-13 00:56   回复  
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Q.K.Zhang3楼
2017-12-13 00:57   回复  
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石崇灯5楼
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乔妞6楼
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wzlei867楼
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3622876189楼
2017-12-13 01:16   回复  
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onesaid12楼
2017-12-13 01:36   回复  
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