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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » overlap PCR一直连接不上去
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
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overlap PCR一直连接不上去
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我分段扩增一个基因的ORF，第一段1400bp，第二段1100bp，分段都扩增出来了（重叠区23bp），但是连不上去呀。
我的体系如下：
第一段、第二段切胶回收纯化后产物各20ng、
taq酶，dNTP，水至48微升。
PCR循环退火54℃，72℃延伸2min30s，5个循环。
加入全长正反引物各1微升，继续普通pcr，35个循环。
跑胶出来在2k以上没有条带，反而1k左右大面积亮带。

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1楼 2017-12-13 00:52:26
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理工学霸

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以试试同源重组

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15楼2017-12-18 08:25:18
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
我猜测可能的几个原因：①回收的浓度太低，第二个片段只有7ng/微升，可能不是我的DNA，②退火温度太低，我看别人的退火温度都在60℃左右，③overlap的退火和延伸时间不够，我的退火30s，延伸2min30s

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11楼2017-12-13 01:25:44
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
求助大神！！

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13楼2017-12-13 09:30:01
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莫落

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
都是1K左右的，说明两个片段绝大部分没有连接上，单个引物把两个小片段单独扩出来了；有以下建议：

1. 回收的片段确实有点低，可以进行PCR加大片段的量，毕竟两个片段都有1K以上了；
2. 开始重叠的PCR循环数可以加多，5个循环实在太少；
3. 如果愿意重新设计引物的话，可以适当增长重叠区域。
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14楼2017-12-13 13:34:00
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hbabc2楼
2017-12-13 00:56   回复  
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Q.K.Zhang3楼
2017-12-13 00:57   回复  
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lamplamp884楼
2017-12-13 00:58   回复  
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石崇灯5楼
2017-12-13 00:58   回复  
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乔妞6楼
2017-12-13 01:03   回复  
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wzlei867楼
2017-12-13 01:06   回复  
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成长中的晴天8楼
2017-12-13 01:12   回复  
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3622876189楼
2017-12-13 01:16   回复  
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sky蒲公英10楼
2017-12-13 01:19   回复  
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onesaid12楼
2017-12-13 01:36   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
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