应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » overlap PCR一直连接不上去
151/1返回列表
查看: 1397  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
已领完
overlap PCR一直连接不上去
领取红包 (小木虫手机app专属红包)

扫一扫，下载小木虫客户端

我分段扩增一个基因的ORF，第一段1400bp，第二段1100bp，分段都扩增出来了（重叠区23bp），但是连不上去呀。
我的体系如下：
第一段、第二段切胶回收纯化后产物各20ng、
taq酶，dNTP，水至48微升。
PCR循环退火54℃，72℃延伸2min30s，5个循环。
加入全长正反引物各1微升，继续普通pcr，35个循环。
跑胶出来在2k以上没有条带，反而1k左右大面积亮带。

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2017-12-13 00:52:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

莫落

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
都是1K左右的，说明两个片段绝大部分没有连接上，单个引物把两个小片段单独扩出来了；有以下建议：

1. 回收的片段确实有点低，可以进行PCR加大片段的量，毕竟两个片段都有1K以上了；
2. 开始重叠的PCR循环数可以加多，5个循环实在太少；
3. 如果愿意重新设计引物的话，可以适当增长重叠区域。
赞一下(2人) 回复此楼
14楼2017-12-13 13:34:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
我猜测可能的几个原因：①回收的浓度太低，第二个片段只有7ng/微升，可能不是我的DNA，②退火温度太低，我看别人的退火温度都在60℃左右，③overlap的退火和延伸时间不够，我的退火30s，延伸2min30s

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
11楼2017-12-13 01:25:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
求助大神！！

发自小木虫Android客户端
回复此楼
13楼2017-12-13 09:30:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

理工学霸

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以试试同源重组

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
15楼2017-12-18 08:25:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
hbabc2楼
2017-12-13 00:56   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
Q.K.Zhang3楼
2017-12-13 00:57   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
lamplamp884楼
2017-12-13 00:58   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
石崇灯5楼
2017-12-13 00:58   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
乔妞6楼
2017-12-13 01:03   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
wzlei867楼
2017-12-13 01:06   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
成长中的晴天8楼
2017-12-13 01:12   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
3622876189楼
2017-12-13 01:16   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
sky蒲公英10楼
2017-12-13 01:19   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
onesaid12楼
2017-12-13 01:36   回复  
凯伦爱佳佳(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
相关版块跳转 我要订阅楼主 凯伦爱佳佳 的主题更新
151/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭