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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » DNA去磷酸化（CIAP）后怎么纯化？
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dulei

木虫 (小有名气)

[交流] DNA去磷酸化（CIAP）后怎么纯化？

我用的是CIAP碱性磷酸酶，照说明书的方法是这样的：
1、配制50uL反应体系。
2、37℃或50℃反应30分钟。
3、苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1）抽提2次。
4、氯仿/异戊醇（24 ：1）抽提1次。
5、添加5 μl的3 M NaOAC。
6、添加125 μl的（2.5倍量）冷乙醇，在-20℃下保冷30～60分钟。
7、离心分离回收沉淀，用200 μl的70％冷乙醇洗净后，减压干燥。
8、用20μl以下的TE Buffer溶解沉淀。

可是，第7步离心，不管怎么离心都得不到沉淀！！（我用13000r/min，离心20min）。
请问高手们都是怎么弄得？？希望给我个详细的步骤。谢谢！！

另外，我想在37℃反应30分钟后，不用3—8步的方法进行纯化，而用纯化试剂盒（例如EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit），可不可以？谢谢！！
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1楼 2009-02-26 10:17:05
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
看不到沉淀不等于没有沉淀
用其他方法也可以
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2楼2009-02-26 10:28:57
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mimisikai

金虫 (小有名气)
用kit吧
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3楼2009-02-26 10:37:40
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qingxiong

木虫 (正式写手)
对，看不到沉淀不等于没有沉淀，用其它方法试试
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4楼2009-02-26 13:53:42
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caoqishu

铜虫 (初入文坛)
不要按照说明书上的。以下是我平时做的步骤（先沉淀后去磷酸）：
1.添加1/10体积的3 M NaOAC。
2.添加2倍无水乙醇，在-20℃下保冷过夜。
3.离心（12000rpm，15min），回收沉淀，用200 μl的70％冷乙醇洗净后，减压干燥。（一般情况都可以看到沉淀，如果没有也没关系，只是量少了点）
4.用20μl-50μl的ddH2O溶解沉淀。
5.配制40uL反应体系，37℃反应30分钟（酶加2μl），再加1μl酶50℃反应15分钟。
6.用回收试剂盒回收即可。
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5楼2009-02-26 15:11:27
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
用NEB的热敏磷酸酶，据说是不需要沉淀的，加热就可以失活
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6楼2009-02-26 16:23:12
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jasco

木虫 (正式写手)
直接用pcr产物回收试剂盒做
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7楼2009-02-26 17:18:46
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by caoqishu at 2009-2-26 15:11:
不要按照说明书上的。以下是我平时做的步骤（先沉淀后去磷酸）：
1.添加1/10体积的3 M NaOAC。
2.添加2倍无水乙醇，在-20℃下保冷过夜。
3.离心（12000rpm，15min），回收沉淀，用200 μl的70％冷乙醇洗净后， ...

去磷酸化后沉淀就跟一般沉淀DNA的方法是一样的,有时就会看不到沉淀,但不等于没有,只要倒酒精时小心一点不倒丢就行,可以接着往下做
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8楼2009-02-26 18:05:19
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