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dulei

木虫 (小有名气)

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[交流] DNA去磷酸化（CIAP）后怎么纯化？

我用的是CIAP碱性磷酸酶，照说明书的方法是这样的：
1、配制50uL反应体系。
2、37℃或50℃反应30分钟。
3、苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1）抽提2次。
4、氯仿/异戊醇（24 ：1）抽提1次。
5、添加5 μl的3 M NaOAC。
6、添加125 μl的（2.5倍量）冷乙醇，在-20℃下保冷30～60分钟。
7、离心分离回收沉淀，用200 μl的70％冷乙醇洗净后，减压干燥。
8、用20μl以下的TE Buffer溶解沉淀。

可是，第7步离心，不管怎么离心都得不到沉淀！！（我用13000r/min，离心20min）。
请问高手们都是怎么弄得？？希望给我个详细的步骤。谢谢！！

另外，我想在37℃反应30分钟后，不用3—8步的方法进行纯化，而用纯化试剂盒（例如EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit），可不可以？谢谢！！

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1楼 2009-02-26 10:17:05

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caoqishu

铜虫 (初入文坛)

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专业: 肿瘤生物治疗

不要按照说明书上的。以下是我平时做的步骤（先沉淀后去磷酸）：
1.添加1/10体积的3 M NaOAC。
2.添加2倍无水乙醇，在-20℃下保冷过夜。
3.离心（12000rpm，15min），回收沉淀，用200 μl的70％冷乙醇洗净后，减压干燥。（一般情况都可以看到沉淀，如果没有也没关系，只是量少了点）
4.用20μl-50μl的ddH2O溶解沉淀。
5.配制40uL反应体系，37℃反应30分钟（酶加2μl），再加1μl酶50℃反应15分钟。
6.用回收试剂盒回收即可。