应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » DNA去磷酸化（CIAP）后怎么纯化？
81/1返回列表
查看: 1293  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

dulei

木虫 (小有名气)

[交流] DNA去磷酸化（CIAP）后怎么纯化？

我用的是CIAP碱性磷酸酶，照说明书的方法是这样的：
1、配制50uL反应体系。
2、37℃或50℃反应30分钟。
3、苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1）抽提2次。
4、氯仿/异戊醇（24 ：1）抽提1次。
5、添加5 μl的3 M NaOAC。
6、添加125 μl的（2.5倍量）冷乙醇，在-20℃下保冷30～60分钟。
7、离心分离回收沉淀，用200 μl的70％冷乙醇洗净后，减压干燥。
8、用20μl以下的TE Buffer溶解沉淀。

可是，第7步离心，不管怎么离心都得不到沉淀！！（我用13000r/min，离心20min）。
请问高手们都是怎么弄得？？希望给我个详细的步骤。谢谢！！

另外，我想在37℃反应30分钟后，不用3—8步的方法进行纯化，而用纯化试剂盒（例如EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit），可不可以？谢谢！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2009-02-26 10:17:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)
看不到沉淀不等于没有沉淀
用其他方法也可以
赞一下 回复此楼
2楼2009-02-26 10:28:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mimisikai

金虫 (小有名气)
用kit吧
回复此楼
3楼2009-02-26 10:37:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qingxiong

木虫 (正式写手)
对，看不到沉淀不等于没有沉淀，用其它方法试试
赞一下 回复此楼
4楼2009-02-26 13:53:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

caoqishu

铜虫 (初入文坛)
不要按照说明书上的。以下是我平时做的步骤（先沉淀后去磷酸）：
1.添加1/10体积的3 M NaOAC。
2.添加2倍无水乙醇，在-20℃下保冷过夜。
3.离心（12000rpm，15min），回收沉淀，用200 μl的70％冷乙醇洗净后，减压干燥。（一般情况都可以看到沉淀，如果没有也没关系，只是量少了点）
4.用20μl-50μl的ddH2O溶解沉淀。
5.配制40uL反应体系，37℃反应30分钟（酶加2μl），再加1μl酶50℃反应15分钟。
6.用回收试剂盒回收即可。
赞一下 回复此楼
5楼2009-02-26 15:11:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
用NEB的热敏磷酸酶，据说是不需要沉淀的，加热就可以失活
赞一下 回复此楼
6楼2009-02-26 16:23:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)
直接用pcr产物回收试剂盒做
赞一下 回复此楼
7楼2009-02-26 17:18:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by caoqishu at 2009-2-26 15:11:
不要按照说明书上的。以下是我平时做的步骤（先沉淀后去磷酸）：
1.添加1/10体积的3 M NaOAC。
2.添加2倍无水乙醇，在-20℃下保冷过夜。
3.离心（12000rpm，15min），回收沉淀，用200 μl的70％冷乙醇洗净后， ...

去磷酸化后沉淀就跟一般沉淀DNA的方法是一样的,有时就会看不到沉淀,但不等于没有,只要倒酒精时小心一点不倒丢就行,可以接着往下做
赞一下 回复此楼
8楼2009-02-26 18:05:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 dulei 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 295求调剂。一志愿报考郑州大学化学工艺学硕，总分295分 +5 yl1 2026-03-02 5/250 2026-03-02 15:24 by sucesssucess
[考研] 0856调剂 +7 刘梦微 2026-02-28 7/350 2026-03-02 14:11 by liyongv
[考研] 材料学硕318求调剂 +9 February_Feb 2026-03-01 9/450 2026-03-02 13:31 by njzyff
[考研] 化工270求调剂 +8 什么名字qwq 2026-03-02 8/400 2026-03-02 13:03 by houyaoxu
[考研] 考研复试调剂，过国家线的同学都可报名 +3 黑！在干嘛 2026-02-28 4/200 2026-03-02 12:20 by 花鱼不是鱼
[考研] 求调剂 +3 熬夜的猫头鹰 2026-03-02 3/150 2026-03-02 11:45 by 刘兵
[考研] 材料工程专硕283求调剂 5+4 ，！？ 2026-03-02 6/300 2026-03-02 11:07 by 黑！在干嘛
[考研] 材料类求调剂 +11 wana_kiko 2026-02-28 14/700 2026-03-02 08:46 by 聪明的大松鼠
[考研] 高分子化学与物理调剂 +6 好好好1233 2026-02-28 13/650 2026-03-02 07:27 by 好好好1233
[考研] 279求调剂 +3 dua1 2026-03-01 4/200 2026-03-02 00:23 by 大脸蛋子
[硕博家园] 博士自荐 +7 科研狗111 2026-02-26 11/550 2026-03-01 22:24 by 哲平L
[考研] 298求调剂 +6 axyz3 2026-02-28 6/300 2026-03-01 19:00 by 18137688336
[考研] 一志愿中南大学理学化学 +4 15779376950 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:00 by Fff-1
[考研] 0856材料求调剂 +11 hyf hyf hyf 2026-02-28 12/600 2026-03-01 18:57 by 18137688336
[考研] 328求调剂 +3 aaadim 2026-03-01 5/250 2026-03-01 17:29 by njzyff
[考研] 321求调剂一志愿东北林业大学材料与化工英二数二 +4 虫虫虫虫虫7 2026-03-01 7/350 2026-03-01 16:52 by caszguilin
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-02-28 7/350 2026-03-01 15:14 by wjLi2017
[考研] 调剂 +3 简木ChuFront 2026-02-28 3/150 2026-03-01 11:46 by 王伟要上岸啊
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +6 Soliloquy_Q 2026-02-28 11/550 2026-03-01 11:14 by 歌liekkas
[考研] 085600材料工程一志愿中科大总分312求调剂 +8 吃宵夜1 2026-02-28 10/500 2026-02-28 20:27 by L135790
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭