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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 外源基因通过RED重组至大肠杆菌染色体上进行目的蛋白高表达
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xiajungang

银虫 (正式写手)

[求助] 外源基因通过RED重组至大肠杆菌染色体上进行目的蛋白高表达 已有2人参与

试验背景：用大肠杆菌表达一目的蛋白，表达量较大，但是重组质粒不稳定，很容易在诱导表达后丢失，且丢失率很高。
试验内容：使用RED重组技术将外源基因和翻译元件一起重组至大肠杆菌染色体上，实现菌细胞边生长边表达目的蛋白。
请问：有哪位大侠有这方面经验吗？效果如何？请赐教。
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吃苦耐劳，勇于创新，乐观热情，积极向上！
1楼 2017-11-14 12:44:34
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呆呆戴戴

新虫 (著名写手)
丢失率是从何得来的

发自小木虫IOS客户端
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2楼2017-11-19 15:28:21
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play0joke

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

同问你的丢失率是如何评判得到的？如果实验目的是获取目的蛋白，你大可以多保存菌株，每次活化少量后扩大表达。
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思维随时转动，脚步永不停息
3楼2017-12-05 14:51:15
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
3楼正解，分装保存鉴定好的菌株，需要使用的时候就拿一支，简单省事。。。
真要通过重组整合到大肠杆菌基因组不是不可以，就是花费的时间精力不合算
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4楼2017-12-06 03:53:50
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

https://www.addgene.org/51625/,https://www.addgene.org/62225/,https://www.addgene.org/71541/ ,http://aem.asm.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=28646112，类似的挺多，这里几个是国内的研究，供参考，可以用这样的系统进行基因敲入。
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为什么
5楼2017-12-06 20:48:30
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

https://www.addgene.org/51625/,https://www.addgene.org/62225/,https://www.addgene.org/71541/ ,http://aem.asm.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=28646112，类似的挺多，这里几个是国内的研究，供参考，可以用这样的系统进行基因敲入。
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为什么
6楼2017-12-06 20:51:50
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lanlihua_011

铁杆木虫 (正式写手)
同求实验过程方法 或经典文献 谢谢
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7楼2018-01-30 22:57:48
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xiajungang

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lanlihua_011 at 2018-01-30 22:57:48
同求实验过程方法 或经典文献 谢谢

@呆呆戴戴，@play0joke, @lanlihua_011

1 培养CFU               
1.1 制备平板：培养基为“LB+15g/L琼脂粉”，15~20 ml/平皿，抗性（K+）平板为在培养基凝固前注入终浓度为30mg/L 硫酸卡那霉素（Kana）。               
1.2 灭菌生理盐水梯度（10-4,10-5,10-6,10-7）稀释样品,根据样品OD600调整稀释梯度。               
1.3 选择合适稀释梯度取0.1~0.2ml涂布K-平板，30摄氏度培养箱内培养18~20 h，获得"笔尖~黄米粒"大小的CFU.建议每个样品至少两个平板（获得足够的CFU）。               
2 点板与培养               
2.1 足够数量0.2 ml"枪头"或牙签灭菌。               
2.2 用记号笔和尺子对K+平板与K-平板划“格格”,建议100格/平皿，“格格”四角对应标记1,2,3,4。               
2.3 用灭菌"枪头"或牙签挑取步骤2获得的CFU，先“点”K+平板，再“点”K-平板,注意对应，数量不低于100个。               
2.4 37摄氏度培养箱内培养14~20 h至肉眼可见CFU。               
2.5 CFU计数：分别对两平板CFU计数，注意对应“格格”，K-平板“格格”内若无CFU生长则该点无效，不计入。               
2.6 质粒丢失率计算公式：质粒丢失率 / %=（K-平板CFU数量  - K+平板CFU数量 ) *100 / K-平板cfu数量
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吃苦耐劳，勇于创新，乐观热情，积极向上！
8楼2018-10-16 11:32:58
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xiajungang

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by soarrow at 2017-12-06 03:53:50
3楼正解，分装保存鉴定好的菌株，需要使用的时候就拿一支，简单省事。。。
真要通过重组整合到大肠杆菌基因组不是不可以，就是花费的时间精力不合算

工程菌在发酵过程中随着异源蛋白的表达，负担越来越重，加上外界营养环境等因素的恶化，会出现重组质粒丢失率急剧上升现象，造成继续培养仅获得更多不含目的蛋白的菌细胞。
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吃苦耐劳，勇于创新，乐观热情，积极向上！
9楼2018-10-16 11:37:27
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