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xiajungang

银虫 (正式写手)

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[求助] 外源基因通过RED重组至大肠杆菌染色体上进行目的蛋白高表达已有2人参与

试验背景：用大肠杆菌表达一目的蛋白，表达量较大，但是重组质粒不稳定，很容易在诱导表达后丢失，且丢失率很高。
试验内容：使用RED重组技术将外源基因和翻译元件一起重组至大肠杆菌染色体上，实现菌细胞边生长边表达目的蛋白。
请问：有哪位大侠有这方面经验吗？效果如何？请赐教。

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吃苦耐劳，勇于创新，乐观热情，积极向上！

1楼2017-11-14 12:44:34

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xiajungang

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引用回帖:

7楼: Originally posted by lanlihua_011 at 2018-01-30 22:57:48
同求实验过程方法或经典文献谢谢

@呆呆戴戴，@play0joke, @lanlihua_011

1 培养CFU
1.1 制备平板：培养基为“LB+15g/L琼脂粉”，15~20 ml/平皿，抗性（K+）平板为在培养基凝固前注入终浓度为30mg/L 硫酸卡那霉素（Kana）。
1.2 灭菌生理盐水梯度（10-4,10-5,10-6,10-7）稀释样品,根据样品OD600调整稀释梯度。
1.3 选择合适稀释梯度取0.1~0.2ml涂布K-平板，30摄氏度培养箱内培养18~20 h，获得"笔尖~黄米粒"大小的CFU.建议每个样品至少两个平板（获得足够的CFU）。
2 点板与培养
2.1 足够数量0.2 ml"枪头"或牙签灭菌。
2.2 用记号笔和尺子对K+平板与K-平板划“格格”,建议100格/平皿，“格格”四角对应标记1,2,3,4。
2.3 用灭菌"枪头"或牙签挑取步骤2获得的CFU，先“点”K+平板，再“点”K-平板,注意对应，数量不低于100个。
2.4 37摄氏度培养箱内培养14~20 h至肉眼可见CFU。
2.5 CFU计数：分别对两平板CFU计数，注意对应“格格”，K-平板“格格”内若无CFU生长则该点无效，不计入。
2.6 质粒丢失率计算公式：质粒丢失率 / %=（K-平板CFU数量 - K+平板CFU数量 ) *100 / K-平板cfu数量