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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » hairpin for VIGS
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

[求助] hairpin for VIGS 已有1人参与

1、像这种反向互补序列是直接送公司合成的，还是设计一半的引物，然后让引物退火成双链？
2、如果是直接合成的，插入载体种还要同时做正、反向插入吗？

以下是原文描述，我不是很懂，求解。
The oligonucleotides PDS-54s and PDS-54as, corresponding to nt 1176–1220 of the Arabidopsis PDS cds, were hybridized to each other and cloned into the SnaBI site of E17-S in the sense or antisense orientation to generate E17-PDS-s and E17-PDS- as, respectively. The oligonucleotides PDS-IR37 and PDS-IR41, corresponding to nt 1176–1212 of the Arabidopsis PDS cds, were hybridized to each other and cloned into the SnaBI site of E17-S
to generate E17-PDS-IR.

The other VIGS vector constructs (pTY-PDS48-IR, pTY-PDS52-IR, pTY-PDS56-IR, pTY-PDS60-IR, pTY-PDS64-IR, pTY-PDS70-IR, pTYPDS76-IR, pTY-PDS2-IR and pTY-LFY-IR) were obtained by cloning the self-hybridized palindromic oligonucleotides PDS48, PDS52, PDS56, PDS60, PDS64, PDS70, PDS76, PDS2-IR and LFY-IR (corresponding to nt 911–949 of the LFY cds), respectively, into the SnaBI site of pTY-S.

This small size therefore allows the introduction of foreign sequences in the viral genome by direct cloning of doublestranded synthetic oligonucleotides. To target a specific gene, we therefore advise that a self-hybridizing palindromic oligonucleotide of 76–80 nt, identical to the target gene
sequence, be inserted into the SnaB1 site of pTY-S, so that hairpin RNAs bearing a stem of 36–38 nt and a 4 nt loop could be generated.

hairpin for VIGS
hp.png
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1楼 2017-10-10 12:35:13
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挑战来了

新虫 (小有名气)
请问你做的是dsRNA合成吗？

发自小木虫Android客户端
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2楼2017-10-10 13:01:00
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很短的片段，一般都是公司直接合成，然后引物对直接退火形成双链，通过粘性末端或者同源重组的方式连接到目的载体的。
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
3楼2017-10-10 15:01:14
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
请问你做这种发卡结构的vigs，效果如何，或者你所知道的其他人这样做，效果如何？
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
4楼2017-10-10 15:01:59
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2017-10-10 15:01:14
很短的片段，一般都是公司直接合成，然后引物对直接退火形成双链，通过粘性末端或者同源重组的方式连接到目的载体的。

比如说图中第一条PDS48，它其实左边是一条24bp的寡核苷酸，右边是反向互补序列，那么合成的时候只合成24bp？那退火成双链是引物二聚体吧，也形成不了双链啊？还是说直接合成48bp的寡核苷酸？
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5楼2017-10-11 09:30:04
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2017-10-10 15:01:59
请问你做这种发卡结构的vigs，效果如何，或者你所知道的其他人这样做，效果如何？

我之前做VIGS并没有用到发卡结构，直接反向插入的200-400bp的片段，在烟草上很好，但是在柑橘上不行，所以想尝试用发卡，我不知道别人做这个效果怎样，我是看到文献上这么做的。一般的VIGS用不着发卡结构
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6楼2017-10-11 09:31:53
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 挑战来了 at 2017-10-10 13:01:00
请问你做的是dsRNA合成吗？

不是，这个不是dsRNA，是回文结构的寡核苷酸，我只是不知道它是怎么做的
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7楼2017-10-11 09:32:48
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 挑战来了 at 2017-10-10 13:01:00
请问你做的是dsRNA合成吗？

dsRNA一般是体外转录得到的，公司应该也可以合成
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8楼2017-10-11 09:33:18
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
引用回帖:
5楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2017-10-11 09:30:04
比如说图中第一条PDS48，它其实左边是一条24bp的寡核苷酸，右边是反向互补序列，那么合成的时候只合成24bp？那退火成双链是引物二聚体吧，也形成不了双链啊？还是说直接合成48bp的寡核苷酸？...

双链倒来倒去很乱，容易迷糊

直接合成全长就可以了
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
9楼2017-10-11 12:42:28
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2017-10-11 12:42:28
双链倒来倒去很乱，容易迷糊

直接合成全长就可以了...

那插入载体时是不是就不用考虑正反向的问题了，合成时在回文寡核苷酸链两端加上酶切位点就可以了吧
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10楼2017-10-11 16:29:43
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