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新虫 (初入文坛)

[求助] pcr没有条带 已有1人参与

我有两条相同来源的基因序列,其功能也相似,但是其中一条扩增不出来,另一条却可以,模板是一样的基因组。扩增不出来的序列是1400bp左右,引物设计的是同源重组的引物,一条tm值是59.4,一条是62.6,我做梯度pcr从50到62都没有条带

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Mannix Li

新虫 (初入文坛)

既然pcr没有条带,那就要考虑是不是引物问题或者模板问题

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2楼2017-10-02 18:08:45
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Mannix Li

新虫 (初入文坛)

模板有可能被降解了,或者是引物本来就和你基因序列结合不上

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3楼2017-10-02 18:09:43
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新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Mannix Li at 2017-10-02 18:09:43
模板有可能被降解了,或者是引物本来就和你基因序列结合不上

模板肯定没有问题,因为我另外一条基因能p出来,引物是按照基因序列设计的,应该不会有问题的吧

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4楼2017-10-02 18:31:22
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香蕉芒果99

新虫 (小有名气)

多设计几条引物,筛选出可以用的。

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5楼2017-10-02 19:05:25
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-10-02 23:25:30
1、用梯度PCR跑,多加一些模板和上下游引物,文献里的退火温度也许并不适合你们实验室的条件,有时候增减0.1度条带差异就很明显。

2、可以降一点退火温度。另外根据你模板序列有没有什么特点,可以根据这些特点,再选择适合的聚合酶。

3、引物参考文献,GC含量有点低,一个34.2%。TM值引物合成单上为45℃,另一个为50℃,但参考文献上退火温度为55℃,扩增目的片段260bp。
及时行乐,人生不留遗憾!
6楼2017-10-02 19:28:22
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7楼2017-10-02 20:08:12
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这里名字

新虫 (初入文坛)

我也是,做等温,咋做都没有目的片段

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8楼2017-10-02 21:06:41
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jiazhuangxue

新虫 (初入文坛)

9楼2018-01-11 15:22:26
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