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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【蛋白质纯化】sumo+HIs-tag 用ulp1酶切后依旧挂Ni柱
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royalshmily

新虫 (初入文坛)

[求助] 【蛋白质纯化】sumo+HIs-tag 用ulp1酶切后依旧挂Ni柱 已有1人参与

我的蛋白石结合SUMO和His-tag的，然后纯化后蛋白样进行了ULP1酶切，通过SDS-PAGE胶检测后知道，蛋白上的SUMO和His是切除了的（从条带大小可以看出来）。但是在此过Ni柱，穿出液里没有目标条带（按理说没有His-tag的蛋白不会和Ni柱结合，穿出液应该有目标条带，SUMO和His应该在N柱上），用10咪唑的Buffer洗脱后，目标条带还是没洗下来，1M咪唑洗全下来了。

酶切条件是4℃，过夜酶切（蛋白质不能室温酶切，怕热 会降解）是我切的时间太长了吗？或者说我应该用20mM、30mM的buffer洗脱吗？但是我纯化蛋白的时候40mM带His和SUMO的目标条带就会被洗下来了。。。

求大神指点迷津！！谢谢！！

SDS图见下↓↓↓

【蛋白质纯化】sumo+HIs-tag 用ulp1酶切后依旧挂Ni柱
labuser 2017-09-14 109(浓、切、b、w10、s)_副本.jpg
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1楼 2017-09-14 21:27:45
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hhz09423

金虫 (正式写手)
你的蛋白序列是怎样？是不是在目标蛋白和sumo之间插入了histag？

发自小木虫IOS客户端
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2楼2017-09-14 23:01:51
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royalshmily

新虫 (初入文坛)
没有。his-tag是加在sumo前面的，切了sumo  his应该就也不在了
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3楼2017-09-20 09:28:19
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Gloriazpp

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

请问你的酶切条件是什么呢，我目前也是表达SUMO融合蛋白，融合蛋白用SUMOO酶切时切不开，请问战友遇到过这种情况吗
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4楼2017-10-16 17:32:20
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candyazhen

新虫 (小有名气)
binding buffer里最好不要有IM试试
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5楼2018-01-24 13:54:02
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