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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCRp不出来？！！！ 已有9人参与

最近在做构建质粒的实验。我是以cDNA为模板p全长为1kb的基因，用连接产物转化DH5a，板上长的单克隆并不多，且菌落比较小，挑单克隆摇菌后进行菌液PCR，之后鉴定没有出现条带，阳性对照也没有条带，请问这种情况会是什么原因呢？载体已经去磷了，引物也没有错。希望知道的朋友能给解答一下，感激不尽！
PCR体系如下：
                                      10ul
                 菌液                2
               10Xbuffer        1
                 taq                0.2
                 dNTPs           0.75
                 F                    0.25
                 R                   0.25
                 ddH2O         5.55
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1楼 2017-08-21 20:38:19
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能量车gogogo

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:29:42
阳性对照都没有条带：
1，可能是感受态有问题，根本就没有转进去，我前段时间也出现过这种跑步出条带的问题，最后发现是买的感受态有问题。
2，可能从一开始就没有连接上，自然也就转化不进去。
3，我一般用20ul 体系做菌液pcr,模板1ul,2Xpremix buffer（已经含有各种dNTP,以及taq酶） 10ul,引物各0.4ul,最后用水补充体系。
4，要是以上都没有问题，但还是跑步出条带，就是引物与模板的结合效率太低，试着重新设计引物把。
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人不会永远十七岁，但永远有人十七岁
16楼2017-09-02 21:36:53
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查看全部 19 个回答

zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, ★有帮助 2017-08-22 11:20:25
用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度，PCR不work证明你的体系有问题，建议通过阳性对照找到问题原因，比如换一下其他的酶试试
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2017-08-22 07:35:44
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, ★有帮助 2017-08-22 11:20:35
菌液最好不要超过0.5UL，里面的杂质会抑制PCR.但你2UL没P出来，也可能没连上。
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2017-08-22 07:55:58
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouxfd at 2017-08-22 07:35:44
用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度，PCR不work证明你的体系有问题，建议通过阳性对照找到问题原因，比如换一下其他的酶试试

“用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度” 请问这句话怎么理解，我没有提质粒，通过阳性对照找问题该怎么做呢？
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4楼2017-08-22 09:01:33
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