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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCRp不出来？！！！ 已有9人参与

最近在做构建质粒的实验。我是以cDNA为模板p全长为1kb的基因，用连接产物转化DH5a，板上长的单克隆并不多，且菌落比较小，挑单克隆摇菌后进行菌液PCR，之后鉴定没有出现条带，阳性对照也没有条带，请问这种情况会是什么原因呢？载体已经去磷了，引物也没有错。希望知道的朋友能给解答一下，感激不尽！
PCR体系如下：
                                      10ul
                 菌液                2
               10Xbuffer        1
                 taq                0.2
                 dNTPs           0.75
                 F                    0.25
                 R                   0.25
                 ddH2O         5.55
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1楼 2017-08-21 20:38:19
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, ★有帮助 2017-08-22 11:20:35
菌液最好不要超过0.5UL，里面的杂质会抑制PCR.但你2UL没P出来，也可能没连上。
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2017-08-22 07:55:58
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查看全部 19 个回答

zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, ★有帮助 2017-08-22 11:20:25
用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度，PCR不work证明你的体系有问题，建议通过阳性对照找到问题原因，比如换一下其他的酶试试
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2017-08-22 07:35:44
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouxfd at 2017-08-22 07:35:44
用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度，PCR不work证明你的体系有问题，建议通过阳性对照找到问题原因，比如换一下其他的酶试试

“用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度” 请问这句话怎么理解，我没有提质粒，通过阳性对照找问题该怎么做呢？
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4楼2017-08-22 09:01:33
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2017-08-22 07:55:58
菌液最好不要超过0.5UL，里面的杂质会抑制PCR.但你2UL没P出来，也可能没连上。

哦  我取菌液1ul的时候，还是一样的体系，一样的酶，单克隆没有条带，但是阳性对照也用1ul时有很浅的条带，为什么2ul就不出来呢？
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5楼2017-08-22 09:04:12
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