应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 单酶切去磷酸化构建的载体
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
61/1返回列表
查看: 2703  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xmcw765

新虫 (初入文坛)

[求助] 单酶切去磷酸化构建的载体 已有3人参与

用xbarI单酶切，去磷酸化后，构建好了载体，测序没问题，但单酶切验证就是切不下来，是什么原因？请各位大神赐教

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2017-08-12 18:53:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2017-08-13 08:55:49
1、XbaI可能受dam甲基化影响, TCTAG(6m)ATC无法切开
2、NdeI+XbaI双切不会有什么问题，但是Nde连接时需要使用平滑末端连接条件，不知你双切后的载体做没有作脱磷
3、为什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序列）先做菌落PCR，能P出来肯定你插入的片断是完整的。
4、不知道你的引物是和载体哪个部分互补的，1-3k的正反两个通用引物就能测通了阿？
赞一下(2人) 回复此楼
及时行乐，人生不留遗憾！
2楼2017-08-12 21:14:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmcw765

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-12 21:14:01
1、XbaI可能受dam甲基化影响, TCTAG(6m)ATC无法切开
2、NdeI+XbaI双切不会有什么问题，但是Nde连接时需要使用平滑末端连接条件，不知你双切后的载体做没有作脱磷
3、为什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序 ...

已经测通了，2k的序列都对，酶切位点也对，就是单酶切验证总是没有目的片段

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2017-08-13 12:46:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmcw765

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-12 21:14:01
1、XbaI可能受dam甲基化影响, TCTAG(6m)ATC无法切开
2、NdeI+XbaI双切不会有什么问题，但是Nde连接时需要使用平滑末端连接条件，不知你双切后的载体做没有作脱磷
3、为什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序 ...

构建载体的时候就是用xbaI单酶切空载，去磷酸化后，与xbaI单酶切的目的片段连接，单克隆提质粒后肯定有目的片段，测序测通了都没问题，就是酶切验证切不下来

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2017-08-13 12:51:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然测序都没问题了，就别纠结了，继续往下做就可以
赞一下(1人) 回复此楼
科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
5楼2017-08-15 17:03:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冯丽妍fly

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

XbaI会受dam甲基化的影响，如果酶切位点后面紧跟着TC，序列TCTAG(6m)ATC不能被识别，结果是不能被切开。之前我的也是这样切不开，之后换了个酶切位点，切出来的大小是对的。楼主可以试着换一下酶切位点。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2017-08-16 15:38:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xmcw765 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿中国科学院大学265求调剂 +6 恬淡ye 2026-03-31 7/350 2026-03-31 11:28 by 恬淡ye
[考研] 347求调剂 +8 山顶见α 2026-03-25 8/400 2026-03-31 10:14 by 不吃魚的貓
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +6 邱gl 2026-03-30 10/500 2026-03-31 07:43 by yishunmin
[考研] 085701环境工程求调剂 +11 多久上课 2026-03-27 12/600 2026-03-30 21:21 by 研究僧导导
[考研] 346求调剂 一志愿070303有机化学 +7 萝卜炖青菜 2026-03-28 8/400 2026-03-30 19:59 by 无际的草原
[考研] 一志愿郑州大学，080500学硕，总分317分求调剂 +10 举个栗子oi 2026-03-24 11/550 2026-03-30 19:31 by michael2011
[考研] 0703一志愿9，初试成绩：338，四六级已过，有科研经历，求调剂！ +7 Zuhui0306 2026-03-25 7/350 2026-03-30 19:01 by 源_2020
[考研] 293求调剂 +3 末未mm 2026-03-30 5/250 2026-03-30 17:23 by 王保杰33
[考研] 332求调剂 +6 @MZB382400 2026-03-28 6/300 2026-03-30 16:57 by 无际的草原
[考研] 329求调剂 +8 星野? 2026-03-26 8/400 2026-03-30 13:41 by chemdavid
[硕博家园] 求调剂 有机化学考研356分 +10 Nadiums 2026-03-25 11/550 2026-03-30 11:56 by yjolah
[考研] 一志愿北京工业大学，324分求调剂 +6 零八# 2026-03-28 6/300 2026-03-29 21:20 by nanaliuyun
[考研] 一志愿武汉理工，总分321，英一数二，求老师收留。 +11 nnnnnnn5 2026-03-25 11/550 2026-03-29 20:42 by 无际的草原
[考研] 329求调剂 +10 钮恩雪 2026-03-25 10/500 2026-03-29 13:32 by peike
[考研] 356求调剂 +4 gysy?s?a 2026-03-28 4/200 2026-03-29 10:32 by 唐沐儿
[考研] 0856求调剂 +13 zhn03 2026-03-25 14/700 2026-03-29 08:13 by fmesaito
[考研] 0703化学求调剂，各位老师看看我！！！ +5 祁祺祺 2026-03-25 5/250 2026-03-27 21:44 by 东方猪猪
[考研] 085600，材料与化工321分调剂 +4 大馋小子 2026-03-27 6/300 2026-03-27 14:11 by 松花缸1201
[考研] 一志愿郑大085600，310分求调剂 +5 李潇可 2026-03-26 5/250 2026-03-27 11:14 by 不吃魚的貓
[考研] 324求调剂 +5 hanamiko 2026-03-26 5/250 2026-03-27 10:33 by wangjy2002
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭