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xmcw765

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[求助] 单酶切去磷酸化构建的载体已有3人参与

用xbarI单酶切，去磷酸化后，构建好了载体，测序没问题，但单酶切验证就是切不下来，是什么原因？请各位大神赐教

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1楼 2017-08-12 18:53:05

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晋鹏

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【答案】应助回帖

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西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2017-08-13 08:55:49

1、XbaI可能受dam甲基化影响, TCTAG(6m)ATC无法切开
2、NdeI+XbaI双切不会有什么问题，但是Nde连接时需要使用平滑末端连接条件，不知你双切后的载体做没有作脱磷
3、为什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序列）先做菌落PCR，能P出来肯定你插入的片断是完整的。
4、不知道你的引物是和载体哪个部分互补的，1-3k的正反两个通用引物就能测通了阿？

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及时行乐，人生不留遗憾！

2楼2017-08-12 21:14:01

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-12 21:14:01
1、XbaI可能受dam甲基化影响, TCTAG(6m)ATC无法切开
2、NdeI+XbaI双切不会有什么问题，但是Nde连接时需要使用平滑末端连接条件，不知你双切后的载体做没有作脱磷
3、为什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序 ...

已经测通了，2k的序列都对，酶切位点也对，就是单酶切验证总是没有目的片段

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3楼2017-08-13 12:46:23

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