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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 单酶切去磷酸化构建的载体
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xmcw765

新虫 (初入文坛)

[求助] 单酶切去磷酸化构建的载体 已有3人参与

用xbarI单酶切，去磷酸化后，构建好了载体，测序没问题，但单酶切验证就是切不下来，是什么原因？请各位大神赐教

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1楼 2017-08-12 18:53:05
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2017-08-13 08:55:49
1、XbaI可能受dam甲基化影响, TCTAG(6m)ATC无法切开
2、NdeI+XbaI双切不会有什么问题，但是Nde连接时需要使用平滑末端连接条件，不知你双切后的载体做没有作脱磷
3、为什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序列）先做菌落PCR，能P出来肯定你插入的片断是完整的。
4、不知道你的引物是和载体哪个部分互补的，1-3k的正反两个通用引物就能测通了阿？
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及时行乐，人生不留遗憾！
2楼2017-08-12 21:14:01
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xmcw765

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-12 21:14:01
1、XbaI可能受dam甲基化影响, TCTAG(6m)ATC无法切开
2、NdeI+XbaI双切不会有什么问题，但是Nde连接时需要使用平滑末端连接条件，不知你双切后的载体做没有作脱磷
3、为什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序 ...

已经测通了，2k的序列都对，酶切位点也对，就是单酶切验证总是没有目的片段

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3楼2017-08-13 12:46:23
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xmcw765

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-12 21:14:01
1、XbaI可能受dam甲基化影响, TCTAG(6m)ATC无法切开
2、NdeI+XbaI双切不会有什么问题，但是Nde连接时需要使用平滑末端连接条件，不知你双切后的载体做没有作脱磷
3、为什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序 ...

构建载体的时候就是用xbaI单酶切空载，去磷酸化后，与xbaI单酶切的目的片段连接，单克隆提质粒后肯定有目的片段，测序测通了都没问题，就是酶切验证切不下来

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4楼2017-08-13 12:51:09
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然测序都没问题了，就别纠结了，继续往下做就可以
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
5楼2017-08-15 17:03:28
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冯丽妍fly

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

XbaI会受dam甲基化的影响，如果酶切位点后面紧跟着TC，序列TCTAG(6m)ATC不能被识别，结果是不能被切开。之前我的也是这样切不开，之后换了个酶切位点，切出来的大小是对的。楼主可以试着换一下酶切位点。
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6楼2017-08-16 15:38:17
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