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荧光定量PCR加入的模板量应该是多少 已有1人参与
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想请教一下各位大神做荧光定量PCR反应实验时，按照说明书，反应体系是20微升，加入的模板量应该是多少合适呢？用内参基因actin还有其他的几个基因做了一下实验，actin基因的CT值在21左右，其他的几个基因的CT值也在20-25附近？ 是根据CT值大小来决定模板用量吧？ 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2017-08-11 20:28:13
晋鹏
版主 (知名作家)
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【答案】应助回帖
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假如模板分子有一个，那么经过一轮PCR，就变成2个，这两个经过又一轮PCR，变成了4个，依次……，发现经过40轮，变成了2的40次方个，伴随着每轮PCR有荧光探针的水解，根据荧光情况判断原始产量，推算初始模板量。 我们实验室一般是用500-1000ngRNA做RT，然后得到20μlcDNA，加入85μl H2O，等于总体积是105μl, 每次做qPCR的时候总体积是25μl: 12.5μl SYBR Green Taq 2x +6.5μl H2O + 0.5μl primer1 10μM +0.5μl primer2 10μM + 5μl cDNA 反正这个条件下我们的qPCR都能做出来，你可以做个参考 |
3楼2017-08-11 21:14:52
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好羡慕你们都说我们实验室啊，呜呜呜，研究生还没入学，被老师逼着做实验，实验室之前只有一个博士师姐做分子方向，然而她已经毕业了。我还想问一下每个重复孔的CT值的标准偏差多少合适呢 发自小木虫Android客户端 |
4楼2017-08-11 23:08:11
5楼2017-08-11 23:08:55
zht930528
木虫 (正式写手)
麻辣王子
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6楼2017-08-16 11:03:01
7楼2017-10-31 17:14:21
50