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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR加入的模板量应该是多少
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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洋小妞baby

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR加入的模板量应该是多少 已有1人参与

想请教一下各位大神做荧光定量PCR反应实验时，按照说明书，反应体系是20微升，加入的模板量应该是多少合适呢？用内参基因actin还有其他的几个基因做了一下实验，actin基因的CT值在21左右，其他的几个基因的CT值也在20-25附近？
是根据CT值大小来决定模板用量吧？

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1楼 2017-08-11 19:21:28
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喜新不厌旧10

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
2楼2017-08-11 20:28:13
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
假如模板分子有一个，那么经过一轮PCR，就变成2个，这两个经过又一轮PCR，变成了4个，依次……，发现经过40轮，变成了2的40次方个，伴随着每轮PCR有荧光探针的水解，根据荧光情况判断原始产量，推算初始模板量。

我们实验室一般是用500-1000ngRNA做RT，然后得到20μlcDNA，加入85μl H2O，等于总体积是105μl, 每次做qPCR的时候总体积是25μl: 12.5μl SYBR Green Taq 2x +6.5μl H2O + 0.5μl primer1 10μM +0.5μl primer2 10μM + 5μl cDNA
反正这个条件下我们的qPCR都能做出来，你可以做个参考
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及时行乐，人生不留遗憾！
3楼2017-08-11 21:14:52
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洋小妞baby

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 喜新不厌旧10 at 2017-08-11 20:28:13
我们实验室逆转录统一加1微克的RNA逆转录完成后的cDNA 稀释一倍后使用25微体系加1微，内参的CT值在15_25之间都是比较理想的

好羡慕你们都说我们实验室啊，呜呜呜，研究生还没入学，被老师逼着做实验，实验室之前只有一个博士师姐做分子方向，然而她已经毕业了。我还想问一下每个重复孔的CT值的标准偏差多少合适呢

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4楼2017-08-11 23:08:11
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洋小妞baby

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-11 21:14:52
假如模板分子有一个，那么经过一轮PCR，就变成2个，这两个经过又一轮PCR，变成了4个，依次……，发现经过40轮，变成了2的40次方个，伴随着每轮PCR有荧光探针的水解，根据荧光情况判断原始产量，推算初始模板量。

...

好的，谢谢

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5楼2017-08-11 23:08:55
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子
引用回帖:
4楼: Originally posted by 洋小妞baby at 2017-08-11 23:08:11
好羡慕你们都说我们实验室啊，呜呜呜，研究生还没入学，被老师逼着做实验，实验室之前只有一个博士师姐做分子方向，然而她已经毕业了。我还想问一下每个重复孔的CT值的标准偏差多少合适呢
...

偏差0.5左右为理想情况，
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麻辣王子不爱做实验
6楼2017-08-16 11:03:01
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45racegirl

新虫 (初入文坛)
楼主，想问一下，我内参的ct值都到35了，其他目的基因的ct值在21左右是正常的，内参基因是人家做同种物种用的，很郁闷

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7楼2017-10-31 17:14:21
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