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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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洋小妞baby

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR加入的模板量应该是多少 已有1人参与

想请教一下各位大神做荧光定量PCR反应实验时,按照说明书,反应体系是20微升,加入的模板量应该是多少合适呢?用内参基因actin还有其他的几个基因做了一下实验,actin基因的CT值在21左右,其他的几个基因的CT值也在20-25附近?
是根据CT值大小来决定模板用量吧?

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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
假如模板分子有一个,那么经过一轮PCR,就变成2个,这两个经过又一轮PCR,变成了4个,依次……,发现经过40轮,变成了2的40次方个,伴随着每轮PCR有荧光探针的水解,根据荧光情况判断原始产量,推算初始模板量。

我们实验室一般是用500-1000ngRNA做RT,然后得到20μlcDNA,加入85μl H2O,等于总体积是105μl, 每次做qPCR的时候总体积是25μl: 12.5μl SYBR Green Taq 2x +6.5μl H2O + 0.5μl primer1 10μM +0.5μl primer2 10μM + 5μl cDNA
反正这个条件下我们的qPCR都能做出来,你可以做个参考
及时行乐,人生不留遗憾!
3楼2017-08-11 21:14:52
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喜新不厌旧10

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

2楼2017-08-11 20:28:13
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洋小妞baby

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 喜新不厌旧10 at 2017-08-11 20:28:13
我们实验室逆转录统一加1微克的RNA逆转录完成后的cDNA 稀释一倍后使用25微体系加1微,内参的CT值在15_25之间都是比较理想的

好羡慕你们都说我们实验室啊,呜呜呜,研究生还没入学,被老师逼着做实验,实验室之前只有一个博士师姐做分子方向,然而她已经毕业了。我还想问一下每个重复孔的CT值的标准偏差多少合适呢

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4楼2017-08-11 23:08:11
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洋小妞baby

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-11 21:14:52
假如模板分子有一个,那么经过一轮PCR,就变成2个,这两个经过又一轮PCR,变成了4个,依次……,发现经过40轮,变成了2的40次方个,伴随着每轮PCR有荧光探针的水解,根据荧光情况判断原始产量,推算初始模板量。

...

好的,谢谢

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5楼2017-08-11 23:08:55
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