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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 反向PCR 测序失败
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Melody灬绝仙

新虫 (初入文坛)

[求助] 反向PCR 测序失败 已有2人参与

经历了几个月的摸索，终于能够扩增出来条带了，可是现在卡在了测序这一步，说是杂带太多。

本人按照一般的反向PCR操作，先使用  EcoR I   和   Hind III   来双酶切基因组，回收之后  T4 连接酶连接，再次回收，使用Takara公司的PrimeSTAR GXL酶来进行反向PCR扩增，结果扩得条带，之前使用PMD18-T载体一直没有连接上，所以直接送PCR回收产物去测序，可是一直是杂带太多，无法测序。各位大牛有没有什么好的建议给小弟。附一张PCR图

反向PCR     测序失败
IMG_20170730_180705.jpg
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1楼 2017-08-01 17:19:11
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Melody灬绝仙

新虫 (初入文坛)
marker是DL10000，前面2个是PCR产物，后面依次是基因组、酶切产物、环化产物
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2楼2017-08-01 17:20:49
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zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-02 07:44:26
PCR产物由于不纯所以不好测序，将产物回收后用taq酶处理链接T载体后再测序
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3楼2017-08-02 01:00:21
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linminchia

新虫 (初入文坛)
請問用雙酶切之後，再用T4連接回原?淼幕蚪M？目的是什麼

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4楼2017-08-02 04:05:31
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Melody灬绝仙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhouxfd at 2017-08-02 01:00:21
PCR产物由于不纯所以不好测序，将产物回收后用taq酶处理链接T载体后再测序

用taq酶处理？没有怎么理解这一步的意思，能具体说说么
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5楼2017-08-02 08:37:36
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六维空想

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Melody灬绝仙 at 2017-08-02 08:37:36
用taq酶处理？没有怎么理解这一步的意思，能具体说说么...

taq酶加a 要不然连不上t载体

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6楼2017-08-02 11:59:32
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Melody灬绝仙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 六维空想 at 2017-08-02 11:59:32
taq酶加a 要不然连不上t载体
...

噢噢，这个我倒是知道，就是加一个A尾，我是想问怎么操作呢，将PCR产物切胶回收后，然后怎么加taq？有详细点的步骤或是相关的文献么？

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7楼2017-08-02 12:47:04
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六维空想

新虫 (小有名气)
我是直接未纯化的pcr产物补加taq酶体系 72℃半个小时

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8楼2017-08-02 16:03:39
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zyfskj

新虫 (著名写手)
你用的酶扩增后有没有加polyA尾巴？

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向我乞求怜悯吧，我会狠狠拒绝的。
9楼2017-08-02 16:57:13
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zyfskj

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by Melody灬绝仙 at 2017-08-02 12:47:04
噢噢，这个我倒是知道，就是加一个A尾，我是想问怎么操作呢，将PCR产物切胶回收后，然后怎么加taq？有详细点的步骤或是相关的文献么？
...

Takara有TA克隆试剂盒

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向我乞求怜悯吧，我会狠狠拒绝的。
10楼2017-08-02 16:57:40
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