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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 生物材料 » 纳米生物材料 » 请教大家一个关于calcein AM/PI染色活/死细胞的实验
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luo_jiaojiao

木虫 (正式写手)

[求助] 请教大家一个关于calcein AM/PI染色活/死细胞的实验 已有5人参与

请教大家一个关于calcein AM/PI染色活/死细胞的实验
先是细胞爬片，在将纳米材料与细胞作用后加入按说明稀释好的calcein AM/PI试剂盒，孵育30min后洗涤，多聚甲醛固定，封片，照共聚焦。现在的问题是，照共聚焦的时候用488nm激发，能同时在相同的细胞上看到红色和绿色荧光，这跟文献报道的同一张图上红色是死细胞 绿色是活细胞不太一样，请问是为什么呢？
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1楼 2017-07-18 04:00:12
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

许为中-4759

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
live/dead，加染料避光30min就好，不需要后面的固定封片，固定就把细胞杀死了，后面选择合适的通道观察拍摄就好了
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2楼2017-07-18 09:34:17
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luo_jiaojiao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 得勝的生命 at 2017-07-18 12:40:44
这个染剂的激发光范围有一些重叠，用共聚焦显微镜看到的确实是这样的。没毛病。

感谢，既然存在这样的问题，请问你们是怎么解决这个问题呢？是不是先用488通道激发，只保留绿色荧光图片，再用535激发，这时候只有红色荧光，然后把这两张图片叠加？
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6楼2017-07-20 02:25:16
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得勝的生命

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by luo_jiaojiao at 2017-07-20 02:25:16
感谢，既然存在这样的问题，请问你们是怎么解决这个问题呢？是不是先用488通道激发，只保留绿色荧光图片，再用535激发，这时候只有红色荧光，然后把这两张图片叠加？...

我没有固定，但是也会有这种现象。我认为是因为confocal的激发光强度比较高，才这样的。如果用一般的荧光显微镜，比较少看到这样子的情况，或者可以调整曝光时间来进行改善。我后来是改用一般荧光显微镜进行观察的。现在可能有两种改进方法，1找个confocal大神帮忙调调看；2，找激发范围差距较大的染剂
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8楼2017-07-20 12:09:17
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yumeng_6964

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by Sunshine_WHL at 2017-09-27 20:53:41
请问活死细胞染色后细胞还是活的吗，可以继续培养吗

不可以继续培养了，细胞会慢慢凋亡，红色会越来越多。
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15楼2017-10-09 16:23:36
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普通回帖

得勝的生命

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
luo_jiaojiao: 金币+5 2017-07-20 02:24:04
这个染剂的激发光范围有一些重叠，用共聚焦显微镜看到的确实是这样的。没毛病。
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3楼2017-07-18 12:40:44
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090420042

金虫 (著名写手)
死活染色，无需后面的固定。
固定导致细胞死亡，由于洗涤不完全，出现了残余染色剂把原来的活细胞重新染色的情况。
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没事瞎溜达
4楼2017-07-18 15:33:32
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纳米所细胞

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
请问对支架上的细胞进行live/dead染色，细胞数量和染色液剂量应该怎么控制
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5楼2017-07-19 11:33:14
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luo_jiaojiao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 090420042 at 2017-07-18 15:33:32
死活染色，无需后面的固定。
固定导致细胞死亡，由于洗涤不完全，出现了残余染色剂把原来的活细胞重新染色的情况。

抱歉，本想把金币分给回复问题的虫友，没想到回帖评分只能操作一次。按照你的说法，如果不固定的话这时候残留的染料仍然是各自染色活细胞和死细胞，就不会出现上述情况了是吗？
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7楼2017-07-20 02:27:19
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zheng0419

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 得勝的生命 at 2017-07-20 12:09:17
我没有固定，但是也会有这种现象。我认为是因为confocal的激发光强度比较高，才这样的。如果用一般的荧光显微镜，比较少看到这样子的情况，或者可以调整曝光时间来进行改善。我后来是改用一般荧光显微镜进行观察的 ...

我也有这个问题，但是我的是用普通的倒置荧光显微镜拍的，分别拍了不同激发下的细胞图，合并时发现同个细胞被两种染料都染色了，请问这个是怎么导致的呢

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9楼2017-07-20 17:43:02
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得勝的生命

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by zheng0419 at 2017-07-20 17:43:02
我也有这个问题，但是我的是用普通的倒置荧光显微镜拍的，分别拍了不同激发下的细胞图，合并时发现同个细胞被两种染料都染色了，请问这个是怎么导致的呢
...

我是减少曝光时间来解决的（减少激发能量）。你细胞是在水凝胶里面还是表面贴附状态。水凝胶的话，我拍的会有不是很多的红绿重叠，我认为可能是多层细胞的原因，也可能是活细胞和死细胞都被困在同一空间。

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10楼2017-07-21 00:05:32
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