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帅气CKH

新虫 (初入文坛)

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[交流] 质粒重组一直做不出来啊，求大神分析一下原因啊，拜托啦！（我会尽可能详细描述）已有11人参与

目前一直在做质粒重组，把目的基因和载体连起来然后进行后续使用，但是反反复复快2个月了，一直没有成功啊，很沮丧，请大神帮忙指点迷津啊

1.酶切：我目前想用pcs2载体（4700bp）与想要的几个基因重组构建，分别是基因A（1700bp），基因B（1300bp），基因C（1000bp）。粘性末端酶切，载体酶切切胶回收，目的基因酶切后过柱纯化，过程顺利（自认为此步应该不会有问题）。
2.连接：按照说明书计算摩尔体积比混合（总体积10ul，酶和buffer个1ul），这么长时间摸过很多条件：目的基因和载体（100ng）比例做过10比1（做得最多），8比1，3比1，5比1，连接时间大部分选择4度过夜，甚至4度反应2天3天也有，15度过夜也做过。（NEB和TAKARA两个公司的都用过，应该不是酶的问题）有时候当没做出克隆我会将没用来转化的液体跑胶看看连上了没，但是可以跑出来N多条带，除了能找到载体和目的基因的2条，从10000bp到1000bp会出现5，6个条带（难道是连接成环状质粒所以跑胶条带很多？那么说连上了？），我是看不懂了。
3.产物转化图版：感受态用的是商品化的dh5a或者top10，步骤一样（冰30min，42度90s，冰3min），最初我用10ul感受态+1ul连接产物没有结果，师兄说多加点，所以我把链接产物一直往上加，最多到过9ul，感受态不变，但是一直没有结果。转化完加dd水200ul摇菌复苏45-60min，我之前其实是用soc摇的，但是实验室soc出了点问题，所以师兄让我用水摇，他之前是可以做出来的，我做阳性对照的时候也可以做出菌落（但是菌落数总不多，不超过200个，而且长得很慢，24h最大的菌落不过1mm左右，感觉效率很低，我阳对加1ul转化，里面有200多ng的质粒），复苏后取100ul图版，37度过夜。结果永远只有阳性对照有菌落，做过载体自连对照，阴性对照，都没有，很沮丧。
问题：难道是dna的数量太少？连接总共就100ng还没有全做转化，毕竟200ng的阳对转的效率也不高啊；难道是我产物和感受态配比不对？最近看到连接产物不应超过体系10%，多了感受态会胀破，难道是因为这个；难道是我用水去复苏导致效率不高，但是我用阳对是可以的呀，不至于做了这么久一个克隆也不长吧？
现在老板让我把基因的pcr产物做ta克隆然后在切下来连，说如果酶切位点在dna两头酶切得到的粘性末端不好，连接效率低，让连到质粒上切的好，不知道是不是这个原因？？？（但是我跑胶出来很多条带说明我脸上了？）
求大家指点迷津啊啊啊啊，做了这么久都没结果，哎

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1楼 2017-07-10 22:24:00

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帅气CKH

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谢谢各位的建议，小弟我今天居然做出菌落了！！！！！加起来有差不多20个呢，准备送测序看看连上没有，希望有个好结果把。
另外这次实验我基本上也是跟之前的步骤大同小异，连接条件差不多，照样用水复苏，唯一不同的是我把体系加大了，直接把5ul的连接产物一口气加到差不多60ul的感受态里（不超过体系10%），结果居然有了！！！！难道是我之前感受态太少了所以长不出来吗。。。。。。要真是这样真是白忙活1个月了，囧。