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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助！基因克隆不出来，要疯了
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眉间芳华

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助！基因克隆不出来，要疯了 已有13人参与

各位大神好，本人菜鸟一枚，最近在克隆基因。基因长1770bp，已经p出了1700多了，但是atg后面的36bp一直出不来，尝试了pfu、taq、extaq、longamp酶。在启动子和基因内部设计引物，p了500bp，发现atg那段的引物设计的也没问题，但就是p不出来全长?~~~已经做了三个多月了，最近总挨老板骂~~·希望有经验的高手们给点建议。小女子不甚感谢~

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1楼 2017-07-03 14:40:41
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六维空想

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你直接在引物上加那些碱基再p一次不就可以了

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4楼2017-07-03 18:51:54
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collins_1

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
为什么是只有一个小段没有p出来呢？
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坚持不懈
2楼2017-07-03 15:06:01
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不日骑士殿

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
测序结果没显示那一段吗？如果后引物没问题，正常来说顺序扩增应该是可以扩出来的呀。
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3楼2017-07-03 16:46:24
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普通回帖

mayunhui

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用染色体步移试剂盒试试
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书到用时方恨少
5楼2017-07-04 10:02:29
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ybxuan88

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
6楼2017-07-04 15:51:13
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贱贱JMe

木虫 (小有名气)

教导主任
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-04 23:00:46
如果情况像你说的一样的，那么更换酶意义不大。扩增出来的结果有缺失，问题要么在引物要么在模板。如果是中间部分有缺失，那就要重新梳理实验设计了，P丢可能性很小吧。
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想做一位科研好人
7楼2017-07-04 17:00:53
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547star

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-04 23:00:58
建议做个BLAST分析看看，大多数公布的序列是否含有那36bp，如果多数的没有的，说明是样本或其他的问题，如果不同来源的序列都是有的，就可能是你们实验的问题。如果纯粹的测序两头测不出来，建议克隆后用距离克隆位点远一点的测序引物来测或测双向。
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为什么
8楼2017-07-04 18:05:56
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖仅楼主可见
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9楼2017-07-04 19:41:23
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hzau103

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 六维空想 at 2017-07-03 18:51:54
你直接在引物上加那些碱基再p一次不就可以了

赞同，你如果确认的话，直接合成长引物的。

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10楼2017-07-04 21:06:53
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