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好不靠谱

新虫 (初入文坛)

[交流] 链霉菌PCR 已有5人参与

我有三个链霉菌的基因片段需要从基因组中克隆出来，可是GC含量很高，设计了引物，但是觉得引物很难弄，用梯度PCR以及touchdown都做了很多次，改过温度，酶，但是还是很难P出目的条带

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1楼 2017-06-30 08:32:47
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ladejueshi

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我建议你在反应体系里加点DMSO

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9楼2017-06-30 20:34:08
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jinhx87

至尊木虫 (知名作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-30 22:58:18
2个关键点：1、DNA聚合酶；2、能否变性。是哪个地方的？
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2楼2017-06-30 08:53:13
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dahai1984

铁虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-30 22:58:35
需要设计特异引物，整个体系是否正确，降低对火温度试试看

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4楼2017-06-30 09:52:21
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jinhx87

至尊木虫 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
因GC含量高，不易变性，从而导致PCR失败。
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7楼2017-06-30 12:43:33
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whdxhxy

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-30 22:58:50
做过几年链霉菌，首先，以gDNA为模板的话首先要保证模板质量高，其次，你的引物质量问题，最后，不知道你的PCR体系是什么样的，建议加入6%体积的DMSO。
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8楼2017-06-30 14:45:38
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普通回帖

mayunhui

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
直接从基因组中克隆基因吗？应该不太可能吧。
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书到用时方恨少
3楼2017-06-30 09:26:41
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好不靠谱

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jinhx87 at 2017-06-30 08:53:13
2个关键点：1、DNA聚合酶；2、能否变性。是哪个地方的？

你好，第二点我不太明白

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5楼2017-06-30 10:37:31
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好不靠谱

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dahai1984 at 2017-06-30 09:52:21
需要设计特异引物，整个体系是否正确，降低对火温度试试看

降低退火温度后，偶尔能P出条带，但是非特异性条带很多，大小吻合的条带去测序后与目的条带并不吻合

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6楼2017-06-30 10:38:53
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好不靠谱

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jinhx87 at 2017-06-30 12:43:33
因GC含量高，不易变性，从而导致PCR失败。

我有预变性

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10楼2017-07-04 15:54:34
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