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luqing8319

对总细菌是可以的，我当时一直没P出来，后来没加mg离子就p出来了
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11楼2009-01-18 17:50:12
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zbq-92

★
lwf991229(金币+1):感谢参与讨论，欢迎常来~ 1-19 21:41
模板的影响很大，如果其中含有抑制Taq的离子或者其它物质如腐殖酸等，也会影响结果。
另外，如果觉得是退火温度的问题，不妨试试先低温40多度循环6-8个，然后再恢复到55度20个循环。我们以前这样做过。
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12楼2009-01-18 18:52:53
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)
楼主不妨把体系说的详细点（每种成分的浓度用量），方便大家找原因
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13楼2009-01-19 16:41:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lwf991229(金币+1):感谢参与讨论，欢迎常来~ 1-19 21:41
培养到目测可以见浑浊的菌液，25ul PCR体系我加1ul就嫌多了
所以跟模板量无关，也跟什么菌液存在的代谢产物无关，都1/25进去什么都很稀了
用好点的酶绝对可以做出来，好的酶不需要去自己调整什么组分浓度的
温度影响虽然大，但是到50度也可以了看你这对引物
pcDNA3.1的测序引物T7、BGH够短的了，印象中是17个碱基，我52度都出来
有人说56度都能P出来
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14楼2009-01-19 19:47:29
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hanshen81

金虫 (正式写手)
我想你最好是用你的体系，扩别的菌试一下，体系中把你的引物、菌换成别的已经成熟的东西（最好是最近别人做过很成熟的菌、引物），这样才能知道，你的Mg、酶、dNTP、菌量是不是失效或者不合适，在排除这些可能影响因素后，才能去考虑你自己的引物是否有问题、菌是否有问题，之前所有的猜测恐怕都是很耽误时间或者徒劳的
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15楼2009-01-20 13:08:37
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88259654

金虫 (小有名气)
我最近也有很多P不出来，感觉好奇怪，有的会有一个小帽子，就是没有想要的带，其他的怎么可以p的出来呢？
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16楼2009-01-20 14:06:32
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chyanqiu

金虫 (小有名气)
我一直用的TAKARA的酶，扩增效果是相当好的，应该没问题；至于Mg2+，TAKARA提供的说明书上会注明需不需要加以及所加量。
    我的建议是，你先将引物跑个电泳，琼脂糖就可以，15min左右，看一下上下游引物带是否存在，或者亮度是否一致，不一致的话要调整。因为，有时候引物合成时，浓度不是他们提供的参数，按照说明书上的加液量溶解，得到的上下游引物浓度相差很大，此时是很难扩增到片段的；还有就是，引物买到之后，溶解之前要离心，使粉末沉降到管底，不然，盖子、管壁上也沾满粉末，开盖之后粉末乱飞，就不是合成的问题了。这些是我和学生们曾经经历过的，呵呵
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17楼2009-01-21 09:55:20
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含笑~

银虫 (正式写手)
谢谢各位了！提前祝大家新年快乐！chyanqiu：引物稀释前离过心，按他说明上稀释的。你说的跑下引物倒是个好办法，我的引物18，19个碱基，这么短，能跑agarose吗？那得用多大浓度的呀？3%？
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18楼2009-01-21 18:21:53
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含笑~

银虫 (正式写手)
谢谢zbq-92  ！
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19楼2009-01-21 18:23:13
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chyanqiu

金虫 (小有名气)
我经常用的是1%的
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20楼2009-01-23 08:58:45
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