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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 构建过表达载体和亚细胞定位GFP载体遇到的几点问题
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jiang6175

铜虫 (初入文坛)

[交流] 构建过表达载体和亚细胞定位GFP载体遇到的几点问题

我的实验的方法
1、在克隆得到目的片段后，由公司返样和质粒。设计去终止密码子的引物，利用得到质粒进行PCR。
2、对过表达载体35S以、GFP载体及目的片段进行双酶切，然后连接。
3、得到阳性菌落，测序发现以下几个问题，希望能得到大家的帮助，也当做是讨论吧。
问题1：其中一个基因插入载体后为何依然出现了终止密码子？
问题2：此时已经出现终止密码子，是否会影响后续的过表达以及亚细胞定位的工作？
问题3：如果连接好的载体不能用作转基因，那有什么好的办法解决这个密码子？（难道重新设计引物再来一次？）

谢谢各位了~~
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1楼 2017-06-13 17:08:17
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
这个问题解决起来也不难，可以私聊

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13楼2017-06-14 09:25:12
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伤何处

木虫 (正式写手)
★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
不知道你说的这个终止密码子是在基因末端出现的还是在中间。如果是在中间，那你就要考虑阅读框了，如果不在阅读框里面，那就不是终止密码子。如果是在基因最后，那会影响亚细胞定位，不会影响过表达。本身我们做过表达的时候，就需要有终止密码子的。只有做C端融合GFP的时候，才要把终止密码子去掉。
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14楼2017-06-25 14:08:39
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jiang6175

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-25 15:08:39
不知道你说的这个终止密码子是在基因末端出现的还是在中间。如果是在中间，那你就要考虑阅读框了，如果不在阅读框里面，那就不是终止密码子。如果是在基因最后，那会影响亚细胞定位，不会影响过表达。本身我们做过表 ...

谢谢您，我这个终止密码子是在基因序列的末端。我们载体本身酶切位点后是有终止密码子的，故而以前他们构建载体时候不论过表达还是细胞定位都不带终止密码子。不知道您们如何操作的

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16楼2017-06-26 08:52:08
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by jiang6175 at 2017-06-26 08:52:08
谢谢您，我这个终止密码子是在基因序列的末端。我们载体本身酶切位点后是有终止密码子的，故而以前他们构建载体时候不论过表达还是细胞定位都不带终止密码子。不知道您们如何操作的
...

哦哦。那如果又出现在末端，对过表达没影响，对亚细胞定位有影响，会提前终止。 我们一般是用BP反应构入门载体，一个带终止密码子，一个不带。
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17楼2017-06-26 09:45:26
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
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20楼2017-07-21 23:56:15
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_Melody

银虫 (小有名气)
★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
会影响亚细胞定位的

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21楼2017-11-01 20:55:18
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fdzjm2楼
2017-06-13 17:32   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
浅语若水3楼
2017-06-13 17:57   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
wangli52084楼
2017-06-13 18:14   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
艾思脉5楼
2017-06-13 18:14   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
gengxin606楼
2017-06-13 18:31   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
也是小白7楼
2017-06-13 18:38   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
？ 发自小木虫Android客户端
tzynew8楼
2017-06-13 19:11   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
y1250772999楼
2017-06-13 19:16   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
朝都10楼
2017-06-13 19:24   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
好 发自小木虫Android客户端
slytjiaofei11楼
2017-06-13 19:47   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
syhorchid12楼
2017-06-13 19:58   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
wdxmu15楼
2017-06-25 19:26   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
一 发自小木虫IOS客户端
万邦翻译18楼
2017-06-27 21:00   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
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wdxmu19楼
2017-06-27 21:32   回复  
nono200922楼
2021-09-20 21:00   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
·
刀劈三关23楼
2021-09-27 13:38   回复  
。
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