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jiang6175

铜虫 (初入文坛)


[交流] 构建过表达载体和亚细胞定位GFP载体遇到的几点问题

我的实验的方法
1、在克隆得到目的片段后,由公司返样和质粒。设计去终止密码子的引物,利用得到质粒进行PCR。
2、对过表达载体35S以、GFP载体及目的片段进行双酶切,然后连接。
3、得到阳性菌落,测序发现以下几个问题,希望能得到大家的帮助,也当做是讨论吧。
问题1:其中一个基因插入载体后为何依然出现了终止密码子?
问题2:此时已经出现终止密码子,是否会影响后续的过表达以及亚细胞定位的工作?
问题3:如果连接好的载体不能用作转基因,那有什么好的办法解决这个密码子?(难道重新设计引物再来一次?)

谢谢各位了~~
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匿名

用户注销 (正式写手)


★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
本帖仅楼主可见
20楼2017-07-21 23:56:15
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Neo2000

木虫 (著名写手)


★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
这个问题解决起来也不难,可以私聊

发自小木虫Android客户端
13楼2017-06-14 09:25:12
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伤何处

木虫 (正式写手)


★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
不知道你说的这个终止密码子是在基因末端出现的还是在中间。如果是在中间,那你就要考虑阅读框了,如果不在阅读框里面,那就不是终止密码子。如果是在基因最后,那会影响亚细胞定位,不会影响过表达。本身我们做过表达的时候,就需要有终止密码子的。只有做C端融合GFP的时候,才要把终止密码子去掉。
14楼2017-06-25 14:08:39
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fdzjm2楼
2017-06-13 17:32   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
2017-06-13 17:57   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
2017-06-13 18:14   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
艾思脉5楼
2017-06-13 18:14   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
2017-06-13 18:38   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
? 发自小木虫Android客户端
2017-06-13 19:16   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
朝都10楼
2017-06-13 19:24   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
好 发自小木虫Android客户端
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