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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 构建过表达载体和亚细胞定位GFP载体遇到的几点问题
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jiang6175

铜虫 (初入文坛)

[交流] 构建过表达载体和亚细胞定位GFP载体遇到的几点问题

我的实验的方法
1、在克隆得到目的片段后，由公司返样和质粒。设计去终止密码子的引物，利用得到质粒进行PCR。
2、对过表达载体35S以、GFP载体及目的片段进行双酶切，然后连接。
3、得到阳性菌落，测序发现以下几个问题，希望能得到大家的帮助，也当做是讨论吧。
问题1：其中一个基因插入载体后为何依然出现了终止密码子？
问题2：此时已经出现终止密码子，是否会影响后续的过表达以及亚细胞定位的工作？
问题3：如果连接好的载体不能用作转基因，那有什么好的办法解决这个密码子？（难道重新设计引物再来一次？）

谢谢各位了~~
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1楼 2017-06-13 17:08:17
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_Melody

银虫 (小有名气)
★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
会影响亚细胞定位的

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21楼2017-11-01 20:55:18
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
这个问题解决起来也不难，可以私聊

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13楼2017-06-14 09:25:12
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伤何处

木虫 (正式写手)
★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
不知道你说的这个终止密码子是在基因末端出现的还是在中间。如果是在中间，那你就要考虑阅读框了，如果不在阅读框里面，那就不是终止密码子。如果是在基因最后，那会影响亚细胞定位，不会影响过表达。本身我们做过表达的时候，就需要有终止密码子的。只有做C端融合GFP的时候，才要把终止密码子去掉。
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14楼2017-06-25 14:08:39
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fdzjm2楼
2017-06-13 17:32   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
浅语若水3楼
2017-06-13 17:57   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
wangli52084楼
2017-06-13 18:14   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
艾思脉5楼
2017-06-13 18:14   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
也是小白7楼
2017-06-13 18:38   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
？ 发自小木虫Android客户端
y1250772999楼
2017-06-13 19:16   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
朝都10楼
2017-06-13 19:24   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
好 发自小木虫Android客户端
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