应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 构建过表达载体和亚细胞定位GFP载体遇到的几点问题
51/1返回列表
查看: 7465  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

jiang6175

铜虫 (初入文坛)

[交流] 构建过表达载体和亚细胞定位GFP载体遇到的几点问题

我的实验的方法
1、在克隆得到目的片段后，由公司返样和质粒。设计去终止密码子的引物，利用得到质粒进行PCR。
2、对过表达载体35S以、GFP载体及目的片段进行双酶切，然后连接。
3、得到阳性菌落，测序发现以下几个问题，希望能得到大家的帮助，也当做是讨论吧。
问题1：其中一个基因插入载体后为何依然出现了终止密码子？
问题2：此时已经出现终止密码子，是否会影响后续的过表达以及亚细胞定位的工作？
问题3：如果连接好的载体不能用作转基因，那有什么好的办法解决这个密码子？（难道重新设计引物再来一次？）

谢谢各位了~~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2017-06-13 17:08:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by jiang6175 at 2017-06-26 08:52:08
谢谢您，我这个终止密码子是在基因序列的末端。我们载体本身酶切位点后是有终止密码子的，故而以前他们构建载体时候不论过表达还是细胞定位都不带终止密码子。不知道您们如何操作的
...

哦哦。那如果又出现在末端，对过表达没影响，对亚细胞定位有影响，会提前终止。 我们一般是用BP反应构入门载体，一个带终止密码子，一个不带。
赞一下 回复此楼
17楼2017-06-26 09:45:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答

Neo2000

木虫 (著名写手)
★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
这个问题解决起来也不难，可以私聊

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
13楼2017-06-14 09:25:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伤何处

木虫 (正式写手)
★
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
不知道你说的这个终止密码子是在基因末端出现的还是在中间。如果是在中间，那你就要考虑阅读框了，如果不在阅读框里面，那就不是终止密码子。如果是在基因最后，那会影响亚细胞定位，不会影响过表达。本身我们做过表达的时候，就需要有终止密码子的。只有做C端融合GFP的时候，才要把终止密码子去掉。
赞一下 回复此楼
14楼2017-06-25 14:08:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
fdzjm2楼
2017-06-13 17:32   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
浅语若水3楼
2017-06-13 17:57   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
wangli52084楼
2017-06-13 18:14   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
艾思脉5楼
2017-06-13 18:14   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
也是小白7楼
2017-06-13 18:38   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
？ 发自小木虫Android客户端
y1250772999楼
2017-06-13 19:16   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
朝都10楼
2017-06-13 19:24   回复  
jiang6175(金币+1): 谢谢参与
好 发自小木虫Android客户端
查看全部 23 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭