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jiang6175

铜虫 (初入文坛)

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虫号: 3520264

[交流] 构建过表达载体和亚细胞定位GFP载体遇到的几点问题

我的实验的方法
1、在克隆得到目的片段后，由公司返样和质粒。设计去终止密码子的引物，利用得到质粒进行PCR。
2、对过表达载体35S以、GFP载体及目的片段进行双酶切，然后连接。
3、得到阳性菌落，测序发现以下几个问题，希望能得到大家的帮助，也当做是讨论吧。
问题1：其中一个基因插入载体后为何依然出现了终止密码子？
问题2：此时已经出现终止密码子，是否会影响后续的过表达以及亚细胞定位的工作？
问题3：如果连接好的载体不能用作转基因，那有什么好的办法解决这个密码子？（难道重新设计引物再来一次？）

谢谢各位了~~

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1楼 2017-06-13 17:08:17

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

伤何处

木虫 (正式写手)

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虫号: 1406557

引用回帖:

16楼: Originally posted by jiang6175 at 2017-06-26 08:52:08
谢谢您，我这个终止密码子是在基因序列的末端。我们载体本身酶切位点后是有终止密码子的，故而以前他们构建载体时候不论过表达还是细胞定位都不带终止密码子。不知道您们如何操作的
...

哦哦。那如果又出现在末端，对过表达没影响，对亚细胞定位有影响，会提前终止。我们一般是用BP反应构入门载体，一个带终止密码子，一个不带。