应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 基因连接、转化，菌液PCR验证，发现片段丢失
51/1返回列表
查看: 1309  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

glc880824

金虫 (小有名气)

[求助] 基因连接、转化，菌液PCR验证，发现片段丢失 已有1人参与

各位大神，现在实验遇到一个棘手的问题，希望大家帮我解决。
2kb的PCR产物与7.9Kb的载体连接，热激转化至大肠JM109。菌液PCR验证阳性菌株，引物在多克隆位点两端设计，大约300kb。菌液PCR结果，大量300bp，有个别1200左右、1000左右、750bp、600bp、350bp 左右等片段，没有2.2kb左右的阳性片段。求各位大神帮我分析下怎么回事？谢谢
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-06-05 20:19:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

邢曙光

木虫 (小有名气)
我都做了两个月了，4k的片段连6k的载体，怎么也出不来阳性菌

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
4楼2017-06-06 00:14:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答

伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-06 07:47:26
首先确定PCR产物上本身没有你用的酶切位点。PCR产物和载体是分别酶切然后电泳切胶回收的么？ 还有就是你的引物载体上是否特异，拿未酶切的载体做模板扩的时候，是只有一个300bp的条带么。
如果还不行，挑几个去测序看下，连上的是什么片段。
赞一下(2人) 回复此楼
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
2楼2017-06-05 22:19:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

glc880824

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-05 22:19:38
首先确定PCR产物上本身没有你用的酶切位点。PCR产物和载体是分别酶切然后电泳切胶回收的么？ 还有就是你的引物载体上是否特异，拿未酶切的载体做模板扩的时候，是只有一个300bp的条带么。
如果还不行，挑几个去测 ...

连接前已经验证，双酶切PCR产物2k，连接前都没有问题，引物也没有问题，扩增载体是300bp。现在就是转化筛选后，转化子菌液PCR片段大小不一，根本没有2k的片段。
赞一下 回复此楼
3楼2017-06-05 23:10:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hzau103

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 邢曙光 at 2017-06-06 00:14:06
我都做了两个月了，4k的片段连6k的载体，怎么也出不来阳性菌

试试多片断链接试剂盒

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2017-06-06 00:22:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭