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[求助] 基因连接、转化，菌液PCR验证，发现片段丢失已有1人参与

各位大神，现在实验遇到一个棘手的问题，希望大家帮我解决。
2kb的PCR产物与7.9Kb的载体连接，热激转化至大肠JM109。菌液PCR验证阳性菌株，引物在多克隆位点两端设计，大约300kb。菌液PCR结果，大量300bp，有个别1200左右、1000左右、750bp、600bp、350bp 左右等片段，没有2.2kb左右的阳性片段。求各位大神帮我分析下怎么回事？谢谢

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1楼 2017-06-05 20:19:19

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伤何处

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【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-06 07:47:26

首先确定PCR产物上本身没有你用的酶切位点。PCR产物和载体是分别酶切然后电泳切胶回收的么？还有就是你的引物载体上是否特异，拿未酶切的载体做模板扩的时候，是只有一个300bp的条带么。
如果还不行，挑几个去测序看下，连上的是什么片段。

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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰

2楼2017-06-05 22:19:38

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glc880824

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-05 22:19:38
首先确定PCR产物上本身没有你用的酶切位点。PCR产物和载体是分别酶切然后电泳切胶回收的么？还有就是你的引物载体上是否特异，拿未酶切的载体做模板扩的时候，是只有一个300bp的条带么。
如果还不行，挑几个去测 ...

连接前已经验证，双酶切PCR产物2k，连接前都没有问题，引物也没有问题，扩增载体是300bp。现在就是转化筛选后，转化子菌液PCR片段大小不一，根本没有2k的片段。

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3楼2017-06-05 23:10:57

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