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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 基因连接、转化，菌液PCR验证，发现片段丢失
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glc880824

金虫 (小有名气)

[求助] 基因连接、转化，菌液PCR验证，发现片段丢失 已有1人参与

各位大神，现在实验遇到一个棘手的问题，希望大家帮我解决。
2kb的PCR产物与7.9Kb的载体连接，热激转化至大肠JM109。菌液PCR验证阳性菌株，引物在多克隆位点两端设计，大约300kb。菌液PCR结果，大量300bp，有个别1200左右、1000左右、750bp、600bp、350bp 左右等片段，没有2.2kb左右的阳性片段。求各位大神帮我分析下怎么回事？谢谢
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1楼 2017-06-05 20:19:19
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-06 07:47:26
首先确定PCR产物上本身没有你用的酶切位点。PCR产物和载体是分别酶切然后电泳切胶回收的么？ 还有就是你的引物载体上是否特异，拿未酶切的载体做模板扩的时候，是只有一个300bp的条带么。
如果还不行，挑几个去测序看下，连上的是什么片段。
赞一下(2人) 回复此楼
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
2楼2017-06-05 22:19:38
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glc880824

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-05 22:19:38
首先确定PCR产物上本身没有你用的酶切位点。PCR产物和载体是分别酶切然后电泳切胶回收的么？ 还有就是你的引物载体上是否特异，拿未酶切的载体做模板扩的时候，是只有一个300bp的条带么。
如果还不行，挑几个去测 ...

连接前已经验证，双酶切PCR产物2k，连接前都没有问题，引物也没有问题，扩增载体是300bp。现在就是转化筛选后，转化子菌液PCR片段大小不一，根本没有2k的片段。
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3楼2017-06-05 23:10:57
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邢曙光

木虫 (小有名气)
我都做了两个月了，4k的片段连6k的载体，怎么也出不来阳性菌

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4楼2017-06-06 00:14:06
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hzau103

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 邢曙光 at 2017-06-06 00:14:06
我都做了两个月了，4k的片段连6k的载体，怎么也出不来阳性菌

试试多片断链接试剂盒

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5楼2017-06-06 00:22:27
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