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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于16s鉴定中假阳性的问题！！
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luckygirl8371

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于16s鉴定中假阳性的问题！！

大家好！最近在做菌株鉴定，可是遇到奇怪的问题。
     1. 我是用16s通用引物27F和1492R扩增16s片段，可是阴性对照总是在1500bp处出现能看到的条带，不管是我换了水，引物，MIX，消毒PCR仪，消毒枪，还是统统在无菌环境下进行，都会出现假阳性，我将阴性的PCR产物送出测序，两次回来的结果都是Pseudomonas poae，这到底是怎么回事呢？老是假阳存在，那扩增出的菌测序结果就不能保证是正确的，各位大神，能帮忙解答一下原因吗？快崩溃了
    2. 明明通过镜检确定是单一菌，菌落PCR测序要么一侧双峰，要么两侧都是双峰；挑单克隆摇菌提取基因组后扩增，送PCR产物还是一侧双峰，这到底是为什么呢？看峰图是从头到尾都是杂峰，但另一端测序的峰图确实好的，双峰的原因就一定是菌不纯吗？要是GC含量高应该是某一段出现杂峰，不该是从头到尾，要是菌不纯，可镜检是单一形态，划板挑单克隆提基因组扩的，怎么会是菌不纯呢？
      困扰的问题，老也解决不了，影响心情，更影响进度，请各位大神帮忙分析一下吧！谢谢大家
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1楼 2017-06-01 15:45:44
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real-times

新虫 (初入文坛)
菌落鉴定，酶一定买没有细菌基因组污染的，一般的Taq都有细菌基因组的污染，可以做个不加模板的对照，如果有带，就是酶有污染

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2楼2017-06-02 06:01:40
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luckygirl8371

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by real-times at 2017-06-02 06:01:40
菌落鉴定，酶一定买没有细菌基因组污染的，一般的Taq都有细菌基因组的污染，可以做个不加模板的对照，如果有带，就是酶有污染

谢谢战友的答复！我用的是MIX，是不是MIX有问题呢？但是有时加菌液的相同条件下扩增不出条带，反而作为阴性对照的水却有条带，那还能说明是MIX的问题吗？
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3楼2017-06-02 15:27:37
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alinka_47

新虫 (初入文坛)
楼主有没有找到解决的办法？我最近在做细菌基因组提取时，液碰到类似问题，除了mix，其它试剂都更换了阴性还是有条带。
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4楼2017-12-05 16:20:19
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ssslogan

新虫 (初入文坛)
请问楼主问题解决了吗？我有一对引物扩增的时候对照也总会有带。求解答呀

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5楼2018-01-22 11:42:11
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LemnisCare

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
6楼2018-11-16 14:03:12
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