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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 双酶切连接不成功
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wy604987664

新虫 (小有名气)

[求助] 双酶切连接不成功 已有3人参与

用赛默飞快切酶Nde1和Sma1双酶切，Nde1和Bamh1双酶切，37℃酶切2小时，连接始终不成功，测序不是没信号就是载体自连。载体确定没问题，酶也没问题。做了3次了，什么问题呢？就差这两个载体实验就做完了，求帮助！！

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1楼 2017-05-18 15:47:53
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胡奎0925

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-21 10:21:34
层主，我现在也在做这个双酶切，有木有好办法确定双切成功，我现在是载体两个酶分开切，而且都是同时用两个酶单酶切，结果是，这俩酶都好使，但是目的基因就没法看是不是酶切成功了，转化后菌长了特别多。怎么改进 ...

我是没有解决，我是为了构建载体，我改用同源重组的方法了
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宁愿被误会，坚决不解释
12楼2017-05-22 17:00:28
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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-19 07:42:31
载体自连的话试试用用去磷酸酶处理一下vector
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2楼2017-05-19 03:36:02
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stabilized

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确认不是酶切不成功？双酶切无法使两种酶活力同时最大，所以可能有切不成功的问题。
赞一下(1人) 回复此楼
坚持！
3楼2017-05-19 08:56:11
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胡奎0925

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我前段也做双酶切，单切都能成功，但双切就是做不出来，我觉得你要确定双切是成功的
赞一下(1人) 回复此楼
宁愿被误会，坚决不解释
4楼2017-05-19 08:58:42
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查看全部 19 个回答
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