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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 双酶切连接不成功
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wy604987664

新虫 (小有名气)

[求助] 双酶切连接不成功已有3人参与

用赛默飞快切酶Nde1和Sma1双酶切，Nde1和Bamh1双酶切，37℃酶切2小时，连接始终不成功，测序不是没信号就是载体自连。载体确定没问题，酶也没问题。做了3次了，什么问题呢？就差这两个载体实验就做完了，求帮助！！

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1楼2017-05-18 15:47:53
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胡奎0925

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我前段也做双酶切，单切都能成功，但双切就是做不出来，我觉得你要确定双切是成功的
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宁愿被误会，坚决不解释
4楼2017-05-19 08:58:42
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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-19 07:42:31
载体自连的话试试用用去磷酸酶处理一下vector
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2楼2017-05-19 03:36:02
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stabilized

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确认不是酶切不成功？双酶切无法使两种酶活力同时最大，所以可能有切不成功的问题。
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坚持！
3楼2017-05-19 08:56:11
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原来，是这样

金虫 (小有名气)
sma1没记错的话是平末端，连接很困难。这个酶好不好用，最好换个位点。

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5楼2017-05-19 09:47:51
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