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海燕追梦

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菌液pcr
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菌液pcr出不来了，菌液pcr的程序，体系应该注意那些问题呢 ？阳参始终出不来，但是换用其它高保真的酶就能p出来，虽然说不同的酶有不同的程序，之前正常pcrTaq酶能出来的，但是为什么Taq酶放在菌液pcr出不来了，阳参都不出。。。。。。。求大神指点一下。出来讨论一下可以吗？

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1楼 2017-04-30 20:22:11
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xingjing437

新虫 (正式写手)
酶失活了呗...

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22楼2017-04-30 20:26:15
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海燕追梦

新虫 (正式写手)
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22楼: Originally posted by xingjing437 at 2017-04-30 20:26:15
酶失活了呗...

其他人之前用这个酶可以的。。。

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23楼2017-04-30 20:34:09
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xingjing437

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23楼: Originally posted by 海燕追梦 at 2017-04-30 20:34:09
其他人之前用这个酶可以的。。。
...

啊，公用的酶更不确定啊…拆一个新酶试试...

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24楼2017-04-30 20:36:29
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好low

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可能浓度太低了？

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25楼2017-04-30 20:37:19
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食品第一人

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加油

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26楼2017-04-30 20:39:30
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海燕追梦

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25楼: Originally posted by 好low at 2017-04-30 20:37:19
可能浓度太低了？

模板菌液的量吗？1ul或者有一点不就可以吗？

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27楼2017-04-30 20:55:16
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海燕追梦

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26楼: Originally posted by 食品第一人 at 2017-04-30 20:39:30
加油

痛苦，目的基因和载体连不上去。。。。

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28楼2017-04-30 20:55:52
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海燕追梦

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24楼: Originally posted by xingjing437 at 2017-04-30 20:36:29
啊，公用的酶更不确定啊…拆一个新酶试试...
...

我用酶切鉴定后再送测序吧，菌液pcr我P不出来，可能我连接不成功，最痛苦的是阳参出不来，我怎么下结论。。。。

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29楼2017-04-30 20:57:51
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稻草人儿

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28楼: Originally posted by 海燕追梦 at 2017-04-30 20:55:52
痛苦，目的基因和载体连不上去。。。。
...

目的基因和vector的比例浓度可能不对，我以前也是这样，先加乙酸钠和乙醇浓缩一下目的基因，再加少量DEPC水溶，然后再做连接试试。

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30楼2017-04-30 21:12:46
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海燕追梦

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30楼: Originally posted by 稻草人儿 at 2017-04-30 21:12:46
目的基因和vector的比例浓度可能不对，我以前也是这样，先加乙酸钠和乙醇浓缩一下目的基因，再加少量DEPC水溶，然后再做连接试试。
...

怎么浓缩？我不会呀

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31楼2017-04-30 21:15:10
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Sean2010

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-30 22:21:38
你的阳性对照是要插入的模板吗？如果阳性对照p不出来，引物有啥问题不？或者镁离子啥的要调整下？

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32楼2017-04-30 21:46:07
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海燕追梦

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32楼: Originally posted by Sean2010 at 2017-04-30 21:46:07
你的阳性对照是要插入的模板吗？如果阳性对照p不出来，引物有啥问题不？或者镁离子啥的要调整下？

是的，相同的pcr体系，Taq酶出不来，其他高保真酶就可以，我想知道它们的pcr程序不一样(热变性，和退火温度的时间不一样)影响会特别大吗？

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33楼2017-04-30 21:52:43
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Sean2010

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33楼: Originally posted by 海燕追梦 at 2017-04-30 21:52:43
是的，相同的pcr体系，Taq酶出不来，其他高保真酶就可以，我想知道它们的pcr程序不一样(热变性，和退火温度的时间不一样)影响会特别大吗？
...

其实貌似是跟引物的退火温度关系更大些，虽然酶的活性和保真性也会影响（结合到模板和引物上啥的）。
我之前试过Taq酶体系优化。从镁离子开始（缓冲溶液不需要优化，引物浓度如果其他高保真酶p的出来也没必要变，dNTP应该也是一定的）。
还有的话退火温度可以比预测的低2-3度试试。
最后一个可能是：你其他高保真酶用了touch down？循环是怎么设计的？
最最后一个小问题：引物二聚体你能在胶的前沿看到吗？

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34楼2017-05-01 02:28:06
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碧碧木虫

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楼主跟我上周出现的情况一毛一样

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35楼2017-05-01 08:20:10
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34楼: Originally posted by Sean2010 at 2017-05-01 02:28:06
其实貌似是跟引物的退火温度关系更大些，虽然酶的活性和保真性也会影响（结合到模板和引物上啥的）。
我之前试过Taq酶体系优化。从镁离子开始（缓冲溶液不需要优化，引物浓度如果其他高保真酶p的出来也没必要变，d ...

pcr后，胶上只能看到特别亮的引物二聚体，但是用其他高保真酶，引物二聚体条带就很微弱。我有怀疑退火温度太高。。

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36楼2017-05-01 12:46:47
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海燕追梦

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35楼: Originally posted by 碧碧木虫 at 2017-05-01 08:20:10
楼主跟我上周出现的情况一毛一样

那你是怎么解决的呢，求告知，非常感谢

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37楼2017-05-01 12:47:08
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海燕追梦

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34楼: Originally posted by Sean2010 at 2017-05-01 02:28:06
其实貌似是跟引物的退火温度关系更大些，虽然酶的活性和保真性也会影响（结合到模板和引物上啥的）。
我之前试过Taq酶体系优化。从镁离子开始（缓冲溶液不需要优化，引物浓度如果其他高保真酶p的出来也没必要变，d ...

都是30个循环，程序都是根据买的酶给的程序做的。

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38楼2017-05-01 12:49:26
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38楼: Originally posted by 海燕追梦 at 2017-05-01 12:49:26
都是30个循环，程序都是根据买的酶给的程序做的。
...

试试把给的预测退货温度降低2-3度。
不行就touch down吧。只是那个时间较长。

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39楼2017-05-01 20:17:24
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海燕追梦

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39楼: Originally posted by Sean2010 at 2017-05-01 20:17:24
试试把给的预测退货温度降低2-3度。
不行就touch down吧。只是那个时间较长。
...

好，谢谢

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40楼2017-05-01 20:17:50
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pandongzi2楼
2017-04-30 20:22   回复  
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coppelia3楼
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cffyau9楼
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eiri10楼
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