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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 用赛默飞的T4连接酶连接目的基因和载体一直连接不上，求大神指点
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0220zy

新虫 (初入文坛)

[求助] 用赛默飞的T4连接酶连接目的基因和载体一直连接不上，求大神指点 已有1人参与

简单介绍一下：我的实验是通过免疫小鼠获得抗体轻链和重链的目的基因，通过XbaI和SacI酶切轻链与质粒载体后，胶回收，用T4连接酶连接。

体系按照T4连接酶说明书上，4ul Buffer，1ul T4连接酶，目的基因和载体的摩尔比为3:1，20ul的总体系。

轻链基因的浓度为70ng/ul（是酶切后用PCR回收试剂盒回收的，没有通过胶回收），载体浓度为55ng/ul（胶回收）。

16°过夜酶切，直接加loading buffer电泳，结果如图：

中间为连接条带，左右为15000和5000marker，我的目的基因为680bp，酶切后质粒为3600bp，连接后条带应该在4300上下。

结果却是感觉被降解了的电泳条带，不知是什么原因？

求大神指点迷津，定重谢！

用赛默飞的T4连接酶连接目的基因和载体一直连接不上，求大神指点
T4 lianjie 4.24.1.jpg@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw
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1楼 2017-04-24 15:09:17
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diezhang

新虫 (小有名气)
想省事的话拿空载体做对照 比空载体大说明有可能插入了目的基因 片段太小的话这个方法比不出来

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12楼2017-05-03 19:02:08
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diezhang

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 0220zy at 2017-05-03 17:45:53
那应该怎么算呢？求大神指教
...

连接后转化挑斑鉴定  连接后没跑过胶啊

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13楼2017-05-03 19:08:49
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普通回帖

0220zy

新虫 (初入文坛)
是不是T4连接酶加入过多也会导致连接不上呢？
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2楼2017-04-28 09:40:17
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0220zy

新虫 (初入文坛)
浓度都是50ng/ul以上，比例也计算得当，而且都是经过了胶回收纯化和pcr纯化的，最后为了提高浓度连水也不加了，电泳还是看不到目的条带，为什么啊。。。。
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3楼2017-04-28 09:41:59
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稻草人儿

新虫 (小有名气)
你是连接之后直接跑胶吗？

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4楼2017-04-30 23:07:23
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稻草人儿

新虫 (小有名气)
你应该在连接完之用用两端的引物做pcr跑胶再看看结果

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5楼2017-04-30 23:18:57
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0220zy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 稻草人儿 at 2017-04-30 23:18:57
你应该在连接完之用用两端的引物做pcr跑胶再看看结果

两端的引物是指扩增轻链目的片段时用的引物吗？连接产物用不用纯化一下呢？

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6楼2017-05-01 13:03:26
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草溪河

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 0220zy at 2017-04-28 09:40:17
是不是T4连接酶加入过多也会导致连接不上呢？

T4不多，倒是buffer多了。你的buffet是10X的吧？连接后跑胶一般看不见，建议pcr扩增或者直接转化。

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7楼2017-05-01 13:04:52
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0220zy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 草溪河 at 2017-05-01 13:04:52
T4不多，倒是buffer多了。你的buffet是10X的吧？连接后跑胶一般看不见，建议pcr扩增或者直接转化。
...

buffer是5×的，最终浓度为1×，我准备试试热激法导入感受态细胞试一试，看看结果如何

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8楼2017-05-02 09:15:31
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0220zy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 草溪河 at 2017-05-01 13:04:52
T4不多，倒是buffer多了。你的buffet是10X的吧？连接后跑胶一般看不见，建议pcr扩增或者直接转化。
...

热激法转化了一下，长出了重组后的菌落

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9楼2017-05-03 09:44:27
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diezhang

新虫 (小有名气)
marker是线性的 质粒是环状的 你的算法不靠谱

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10楼2017-05-03 15:10:03
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