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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » PCR,关于阴性条带污染的求助
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quzhongzhi

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR,关于阴性条带污染的求助 已有1人参与

我跟导师做的是猪星状病毒的PCR检测，现在在做模板的梯度稀释，可是老是出现污染，我模板才250bp，阴性条带却有2000多bp的污染，重复了两遍还是一样。问题是我一个礼拜之前阴性条带还好好的，只是重做了一遍割胶回收再稀释就不行了。稀释引物母液是在超净台通风操作（没有紫外灯灭菌），因为师兄也这么做，他好像没有过这种问题，我的引物感觉真不好说，也有可能水，或者2X taq MIX出现问题，或者我用的ep管有问题。但因为阴性有条带，所以暂时觉得模板割胶回收和稀释应该没事。想知道有没有相似经历的大神，告诉我这么大的片段是由什么引起的。

PCR,关于阴性条带污染的求助
201704080102.jpg
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1楼 2017-04-09 11:11:56
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skull123

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by quzhongzhi at 2017-04-09 22:15:24
我其实快搞了2个礼拜了，今天用新配的引物，新灭菌的dd水，新的mix，新灭菌的ep管，再另一个实验室超净台先紫外灭菌，再通风配体系，但阴性还是污染了，低浓度下也有非特异性扩增，不过确实有可能是枪的问题，因为 ...

如果是eppendorf移液器，拆下枪的下半部分，用以下方法去除DNA污染（这个配方是厂家的指导配方）：
清洗液（10x储存液）配置：30.6g NaCl+39.2gGlycine+523mlddH2O+1N HCl至1000ml
处理方法：10x清洗液稀释成1x，将eppendorf Research plus移液器下半部分拆卸下来各部件，95℃下浸泡30min，用新开封的ddH2O将各部件冲洗干净，60℃烘干或者直接晾干，部件完全冷却后组装起来。
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7楼2017-04-11 17:39:20
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琼娃儿

新虫 (小有名气)
可能是气溶胶污染，可以把实验位置和枪都换一下，看看行不行

发自小木虫IOS客户端
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2楼2017-04-09 11:26:57
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skull123

木虫 (正式写手)
这么说吧，一旦出现污染，很难搞的，或者你可以去另一个距离较远的没有做过这类实验的实验室做这个实验（不要带现有的仪器，试剂过去），还有一个终极武器，合成另一个部位的引物，扩另一个片段，不扩这个片段了


平常pcr的产物和胶、枪头、ep管什么的，如果不要了，就把它们泡在5%的84溶液密封罐子中，满了就直接丢掉，污染的最大源头是扩增产物
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quzhongzhi
3楼2017-04-09 15:35:58
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quzhongzhi

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by skull123 at 2017-04-09 15:35:58
这么说吧，一旦出现污染，很难搞的，或者你可以去另一个距离较远的没有做过这类实验的实验室做这个实验（不要带现有的仪器，试剂过去），还有一个终极武器，合成另一个部位的引物，扩另一个片段，不扩这个片段了
...

我其实快搞了2个礼拜了，今天用新配的引物，新灭菌的dd水，新的mix，新灭菌的ep管，再另一个实验室超净台先紫外灭菌，再通风配体系，但阴性还是污染了，低浓度下也有非特异性扩增，不过确实有可能是枪的问题，因为我没换枪，想起来同一个实验室的人最近老是做连接转化（但他们是做植物的），我的污染片段大小也似乎接近T载体，我们的枪又是共用。。。。。。说到底，这DNA污染，简直怀疑人生。
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4楼2017-04-09 22:15:24
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