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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 快酶切8小时的异常现象求助
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反对派

银虫 (正式写手)

[求助] 快酶切8小时的异常现象求助 已有1人参与

本人用TAKARA的快酶切对pET-28a(分子量5369 bp)进行三种方式的酶切，酶切时间均为8小时。得到如下结果，很不解，请问问题出在哪里？
从左至右依次为
泳道1.  5微升（约0.5μg）质粒空质粒pET-28a，不酶切（对照）；
泳道2.  空孔（破了未上样）；
泳道3. 5微升（约0.5μg）质粒pET-28a,  1微升 BamH I ， 1微升buffer，3微升水单酶切；
泳道4. 20微升（约2.5 μg）质粒pET-28a，Nde I、Xho I 各4微升，buffer 8微升，水44微升；
泳道5. Supercoiled Marker(超螺旋DNA marker)
泳道6. 15微升（约1.5 μg）质粒pET-28a， BamH I 、Xho I 各4微升，buffer 8微升，水49微升.
酶切温度为37℃，酶切体系没有错。
我的疑问：酶切（不管是双酶切，还是单酶切）后，质粒变为线状，电泳的速度比超螺旋的空质粒慢，现在刚好相反（比超螺旋DNA要快很多），是什么原因？ 是快酶不能长时间切吗？ 还是公司卖给我的酶有问题（以前用fermentas的快酶酶切的时候从未出现这种问题）？
恳请有经验的同行指教！

快酶切8小时的异常现象求助
快酶酶切8小时异常现象.jpg
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1楼 2017-04-06 09:27:51
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
谁说的质粒一定是超螺旋？
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2楼2017-04-06 09:35:34
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反对派

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-04-06 09:35:34
谁说的质粒一定是超螺旋？

我电泳过的，最亮的那一条带是超螺旋的，与takara supercoiled marker 的5000-6000分子量相符。
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3楼2017-04-06 10:07:15
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反对派

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-04-06 09:35:34
谁说的质粒一定是超螺旋？

谢谢回复！
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4楼2017-04-06 10:07:31
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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
反对派: 金币+1, ★有帮助, 、热心 2017-04-21 16:08:47
从图上看，你的单酶切和双酶切一样的结果，还是我看错了，是第三个和第四个吧，中间隔了一个
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5楼2017-04-21 13:52:10
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反对派

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 爱萌的小天使 at 2017-04-21 13:52:10
从图上看，你的单酶切和双酶切一样的结果，还是我看错了，是第三个和第四个吧，中间隔了一个

谢谢你的回复！
我这个胶一共6个泳道。第二个孔因为拨梳子的时候拔破了，未上样。
我说的是泳道从左到右的顺序。
单酶切和双酶切结果一样，而且切了以后的质粒比没有切的跑得还快！
如题！因为开始双酶切 1微克质粒，切了3个小时，切胶回收后与目的片段连接转化长出来的全部都是空质粒。
后来改用切8小时，结果就是这样的。
请回复些实质的问题。
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6楼2017-04-21 16:03:05
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起风了521

新虫 (小有名气)
你的点样孔为什么这么亮？还有抽完的质粒可以直接跑胶吗？超螺旋的话它的大小是质粒的大小吗？

发自小木虫Android客户端
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7楼2019-04-12 11:29:11
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细菌也疯狂

新虫 (初入文坛)
原因有很多，有可能是你胶的问题，可以尝试再放低一点胶浓度，因为我看你的marker还没跑开。
然后你的对照质粒也有点问题，完整质粒跑出来一般是有2-3条带的，不知道是你浓度低还是别的，我只看到一条带
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8楼2019-04-29 16:47:52
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