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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 定点突变PCR失败，找不到原因
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辛辰昊

金虫 (小有名气)

[求助] 定点突变PCR失败，找不到原因 已有4人参与

我现在做一步PCR突变所遇到的问题是，在PCR和DpnI处理后转到JM109中，实验组都在抗性平板上长出来了，且对照组并没有长（对照组是质粒模板用DpnI处理相同时间后的产物），做完以后送去测序，一部分突变点成功突变了，一部分没有（完全跟模板一样）。让我费解的是，既然对照组没长，就说明DpnI消化没问题，那么实验组长出来的应该都是成功的突变体，可是为什么测序后发现会有失败呢？请指教，谢谢！
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1楼 2017-04-05 15:45:19
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR没有产生突变。有目的克隆就行了。
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2楼2017-04-05 16:20:01
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辛辰昊

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-04-05 16:20:01
PCR没有产生突变。有目的克隆就行了。

您好，我就是要做定点突变，现在的问题是，用含有突变点的引物做PCR，得到的产物却不含突变点。
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3楼2017-04-06 09:45:26
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的对照组是怎么设置的
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与人玫瑰手有余香
4楼2017-04-06 15:45:57
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 辛辰昊 at 2017-04-06 09:45:26
您好，我就是要做定点突变，现在的问题是，用含有突变点的引物做PCR，得到的产物却不含突变点。...

你的模板加的太多，另外，引物有没有问题

发自小木虫Android客户端
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我选择，我喜欢；我喜欢我的选择。
5楼2017-04-06 16:53:47
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辛辰昊

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 路人甲007 at 2017-04-06 15:45:57
你的对照组是怎么设置的

您好！我的对照组就是在DpnI消化体系中，把加入的PCR产物改成加入原质粒模板，其它相同。
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6楼2017-04-07 12:18:10
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辛辰昊

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2017-04-06 16:53:47
你的模板加的太多，另外，引物有没有问题
...

如果是模板加太多的原因，那么我的对照组没长，不可以说明DpnI消化已经完全吗？引物方面，我设计的总碱基长度是27，突变的点在中间，两边各12个，设计上应该没问题吧？
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7楼2017-04-07 12:23:21
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chenweijlu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
辛辰昊: 金币+10, ★★★很有帮助 2017-04-15 10:28:46
肯定是模板没有除尽，这从你的测序结果可以看出，至于你对照组也没长，会有多方面原因，建议PC做R一个负对照（不加引物），
实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。
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8楼2017-04-07 13:04:11
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LuL123

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

亲，你们做突变有没有PCR扩增产物就直接堵在胶孔里面的呀？
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9楼2017-07-04 17:14:59
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18734780938

铁虫 (初入文坛)
您好！请问您的问题解决么吗？求方法
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10楼2017-10-20 14:10:01
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