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辛辰昊

金虫 (小有名气)

[求助] 定点突变PCR失败,找不到原因已有4人参与

我现在做一步PCR突变所遇到的问题是,在PCR和DpnI处理后转到JM109中,实验组都在抗性平板上长出来了,且对照组并没有长(对照组是质粒模板用DpnI处理相同时间后的产物),做完以后送去测序,一部分突变点成功突变了,一部分没有(完全跟模板一样)。让我费解的是,既然对照组没长,就说明DpnI消化没问题,那么实验组长出来的应该都是成功的突变体,可是为什么测序后发现会有失败呢?请指教,谢谢!
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR没有产生突变。有目的克隆就行了。
2楼2017-04-05 16:20:01
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辛辰昊

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-04-05 16:20:01
PCR没有产生突变。有目的克隆就行了。

您好,我就是要做定点突变,现在的问题是,用含有突变点的引物做PCR,得到的产物却不含突变点。
3楼2017-04-06 09:45:26
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的对照组是怎么设置的
与人玫瑰手有余香
4楼2017-04-06 15:45:57
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 辛辰昊 at 2017-04-06 09:45:26
您好,我就是要做定点突变,现在的问题是,用含有突变点的引物做PCR,得到的产物却不含突变点。...

你的模板加的太多,另外,引物有没有问题

发自小木虫Android客户端
我选择,我喜欢;我喜欢我的选择。
5楼2017-04-06 16:53:47
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辛辰昊

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 路人甲007 at 2017-04-06 15:45:57
你的对照组是怎么设置的

您好!我的对照组就是在DpnI消化体系中,把加入的PCR产物改成加入原质粒模板,其它相同。
6楼2017-04-07 12:18:10
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辛辰昊

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2017-04-06 16:53:47
你的模板加的太多,另外,引物有没有问题
...

如果是模板加太多的原因,那么我的对照组没长,不可以说明DpnI消化已经完全吗?引物方面,我设计的总碱基长度是27,突变的点在中间,两边各12个,设计上应该没问题吧?
7楼2017-04-07 12:23:21
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chenweijlu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
辛辰昊: 金币+10, ★★★很有帮助 2017-04-15 10:28:46
肯定是模板没有除尽,这从你的测序结果可以看出,至于你对照组也没长,会有多方面原因,建议PC做R一个负对照(不加引物),
实验管由于PCR时有引物,所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物,而对照管由于PCR时没放引物,所以在DPNI处理前里面只有模板。
8楼2017-04-07 13:04:11
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LuL123

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

亲,你们做突变有没有PCR扩增产物就直接堵在胶孔里面的呀?
9楼2017-07-04 17:14:59
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18734780938

铁虫 (初入文坛)

您好!请问您的问题解决么吗?求方法
10楼2017-10-20 14:10:01
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