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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » PC3.1插入一个1200bp的片段怎么都不成功，求助
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哦嗯啊

新虫 (初入文坛)

[交流] PC3.1插入一个1200bp的片段怎么都不成功，求助 已有4人参与

如题，想在ＰＣ３.１上插入一个１２００ｂｐ的片段
ＰＣ３.１和目的片段用Ｎｏｔ１和Ｘｏｈ１双酶切２小时，ＰＣ３.１　５’断还去磷酸化
胶回收的时候显示的条带大小和亮度都非常好了
１６度连接过夜
转化到大肠杆菌之后，经过抗性筛选长出来好几十个菌落，但是菌落ＰＣＲ，只看见引物二聚体，用的引物一个是通用引物，一个是自己的引物
为什么，每一次都是假阳性
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1楼 2017-03-31 15:13:49
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Janual

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
对片段来说，切的时间短了。

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2楼2017-03-31 15:48:58
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dragonhmw

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不用去磷酸化了，会降低链接效率

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3楼2017-03-31 22:44:05
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
PCR出问题了？做个阴性阳性对照，或者试下提质粒酶切验证，祝好

发自小木虫Android客户端
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上班族，学习ing……
4楼2017-03-31 23:32:07
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哦嗯啊

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dragonhmw at 2017-03-31 22:44:05
不用去磷酸化了，会降低链接效率

为什么去磷酸化会降低连接效率
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5楼2017-04-05 21:51:49
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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
很多情况P出来引物二聚体是酶的问题，我之前用的rTaq，后来换了新的ExTaq就P出来了，而且全是阳性的
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6楼2017-04-21 13:57:38
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