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哦嗯啊

新虫 (初入文坛)

应助: 8 (幼儿园)
金币: -8.5
帖子: 27
在线: 9.9小时
虫号: 4466931
注册: 2016-03-04
专业: 生物化学

[交流] PC3.1插入一个1200bp的片段怎么都不成功，求助已有4人参与

如题，想在ＰＣ３.１上插入一个１２００ｂｐ的片段
ＰＣ３.１和目的片段用Ｎｏｔ１和Ｘｏｈ１双酶切２小时，ＰＣ３.１　５’断还去磷酸化
胶回收的时候显示的条带大小和亮度都非常好了
１６度连接过夜
转化到大肠杆菌之后，经过抗性筛选长出来好几十个菌落，但是菌落ＰＣＲ，只看见引物二聚体，用的引物一个是通用引物，一个是自己的引物
为什么，每一次都是假阳性

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1楼 2017-03-31 15:13:49

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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)

应助: 3 (幼儿园)
金币: 56.3
帖子: 24
在线: 10.3小时
虫号: 4441900
注册: 2016-02-27
性别: MM
专业: 微生物生理与生物化学

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

很多情况P出来引物二聚体是酶的问题，我之前用的rTaq，后来换了新的ExTaq就P出来了，而且全是阳性的

6楼2017-04-21 13:57:38

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Janual

银虫 (小有名气)

应助: 3 (幼儿园)
金币: 526.1
散金: 50
红花: 2
帖子: 160
在线: 125.7小时
虫号: 1422638
注册: 2011-09-29
专业: 抗肿瘤药物药理

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

对片段来说，切的时间短了。

发自小木虫IOS客户端

2楼2017-03-31 15:48:58

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dragonhmw

铁杆木虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
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红花: 39
帖子: 765
在线: 351.2小时
虫号: 1565043
注册: 2012-01-05
性别: GG
专业: 兽医传染病学

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

不用去磷酸化了，会降低链接效率

发自小木虫Android客户端

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3楼2017-03-31 22:44:05

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dhmdddd

木虫 (正式写手)

应助: 10 (幼儿园)
贵宾: 0.01
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红花: 3
帖子: 815
在线: 561小时
虫号: 839789
注册: 2009-09-03
性别: MM
专业: 微生物遗传育种学

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

PCR出问题了？做个阴性阳性对照，或者试下提质粒酶切验证，祝好

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上班族，学习ing……

4楼2017-03-31 23:32:07

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