[交流] 全质粒定点突变PCR,挑阳性克隆子测序，目的基因在突变点附近多了很多bp，求大神帮助

本人最近在做全质粒定点饱和突变PCR 模板质粒是pET-28a，连了一个900多bp的目的基因。 目的基因的序列是 ATGGGCGCAGCACCGCAGGTTCGCACCAGTGCACCGGGCTATTATCGTATGCTGCTGGGCGACTTTGAAATCACAGCCCTGAGCGATGGCACCGTGGCCCTGCCTGTGGATAAACGTCTGAATCAGCCTGCCCCGAAAACCCAGAGTGCCCTGGCCAAGTCTTTTCAGAAGGCACCGCTGGAGACCAGCGTGACCGGCTACCTGGTGAACACCGGCAGTAAGCTGGTTCTGGTGGACACCGGCGCAGCCGGTCTGTTCGGTCCGACACTGGGTCGCCTGGCAGCCAATCTGAAAGCCGCAGGCTATCAGCCGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACCCGGATCATGTGGGTGGCCTGATGGTGGGCGAACAGCTGGCATTTCCGAATGCAGTGGTTCGCGCCGATCAGAAAGAGGCCGATTTTTGGCTGAGCCAGACCAATCTGGATAAAGCCCCGGATGACGAGAGCAAGGGCTTTTTTAAGGGCGCTATGGCTAGCCTGAATCCGTACGTGAAAGCCGGCAAATTTAAACCGTTTAGTGGCAATACCGATCTGGTGCCGGGCATCAAAGCCCTGGCAAGCCACGGTCACACCCCGGGTCATACCACTTATGTTGTGGAGAGCCAAGGCCAAAAACTGGCCCTGCTGGGCGATCTGATTCTGGTTGCAGCCGTTCAGTTCGACGATCCGAGCGTGACCACACAGCTGGATAGCGACAGCAAAAGCGTGGCCGTGGAGCGCAAAAAAGCATTTGCCGATGCAGCCAAGGGCGGTTACCTGATTGCCGCAAGTCATCTGAGCTTTCCGGGTATCGGCCATATTCGTGCCGAAGGTAAAGGCTACCGCTTCGTGCCGGTGAACTACAGCGTGGTGAACCCGAAGCATCATCATCATCACCATTAA 引物，上游是：  ACCCACATGCACNNKGATCAT            下游是：GATGTAGATTTCGTCCACCTGTTCC PCR之后，序列对比发现多了100多个碱基，而且全是在突变位点附近。重复的序列包含了引物的上下游 测序结果： GCGCAGCACCGCAGGTTCGCACCAGTGCACCGGGCTATTATCGTATGCTGCTGGGCGACTTTGAAATCACAGCCCTGAGCGATGGCACCGTGGCCCTGCCTGTGGATAAACGTCTGAATCAGCCTGCCCCGAAAACCCAGAGTGCCCTGGCCAAGTCTTTTCAGAAGGCACCGCTGGAGACCAGCGTGACCGGCTACCTGGTGAACACCGGCAGTAAGCTGGTTCTGGTGGACACCGGCGCAGCCGGTCTGTTCGGTCCGACACTGGGTCGCCTGGCAGCCAATCTGAAAGCCGCAGGCTATCAGCCGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCCCCACATGCACGATGATCATGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACGCTGATCATGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACGGTGATCATGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACCTGGATCATAGCCGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACCAGGATCATGTCAGGCTATCAGCCGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACCCGGATCATGTGGGTGGCCTGATGGTGGGCGAACAGCTGGCATTTCCGAATGCAGTGGTTCGCGCCGATCAGAAAGAGGCCGATTTTTGGCTGAGCCAGACCAATCTGGATAAAGCCCCGGATGACGAGAGCAAGGGCTTTTTTAAGGGCGCTATGGCTAGCCTGAATCCGTACGTGAAAGCCGGCAAATTTAAACCGTTTAGTGGCAATACCGATCTGGTGCCGGGCATCAAAGCCCTGGCAAGCCACGGTCACACCCCGGGTCATACCACTTATGTTGTGGAGAGCCAAGGCCAAAAACTGGCCCTGCTGGGCGATCTGATTCTGGTTGCAGCCGTTCAGTTCGACGATCCGAGCGTGACCACACAGCTGGATAGCGACAGCAAAAGCGTGGCCGTGGAGCGCAAAAAAGCATTTGCCGATGCAGCCAAGGGCGGTTACCTGATTGCCGCAAGTCATCTGAGCTTTCCGGGTATCGGCCATATTCGTGCCGAAGGTAAAGGCTACCGCTTCGTGCCGGTGAACTACAGCGTGGTGAACCCGAAGCATCATCATCATCACCATTAA BLAST 对比结果如图 想请问下，这是怎么回事呢？？？？？很不理解，老师也很不理解，说没遇到过。但是我和另一个做这个课题的同学都遇到了。求大神帮忙找找原因？ `)VG0ZBII[W{U9I0D7($[]N.png F8BV`W5$K3)[@)H1{}ZQ(US.png Q%N43ISGT8HB2LZ3]$85))B.png

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