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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 全质粒定点突变PCR,挑阳性克隆子测序，目的基因在突变点附近多了很多bp，求大神帮助
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

[交流] 全质粒定点突变PCR,挑阳性克隆子测序，目的基因在突变点附近多了很多bp，求大神帮助

本人最近在做全质粒定点饱和突变PCR
模板质粒是pET-28a，连了一个900多bp的目的基因。
目的基因的序列是
ATGGGCGCAGCACCGCAGGTTCGCACCAGTGCACCGGGCTATTATCGTATGCTGCTGGGCGACTTTGAAATCACAGCCCTGAGCGATGGCACCGTGGCCCTGCCTGTGGATAAACGTCTGAATCAGCCTGCCCCGAAAACCCAGAGTGCCCTGGCCAAGTCTTTTCAGAAGGCACCGCTGGAGACCAGCGTGACCGGCTACCTGGTGAACACCGGCAGTAAGCTGGTTCTGGTGGACACCGGCGCAGCCGGTCTGTTCGGTCCGACACTGGGTCGCCTGGCAGCCAATCTGAAAGCCGCAGGCTATCAGCCGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACCCGGATCATGTGGGTGGCCTGATGGTGGGCGAACAGCTGGCATTTCCGAATGCAGTGGTTCGCGCCGATCAGAAAGAGGCCGATTTTTGGCTGAGCCAGACCAATCTGGATAAAGCCCCGGATGACGAGAGCAAGGGCTTTTTTAAGGGCGCTATGGCTAGCCTGAATCCGTACGTGAAAGCCGGCAAATTTAAACCGTTTAGTGGCAATACCGATCTGGTGCCGGGCATCAAAGCCCTGGCAAGCCACGGTCACACCCCGGGTCATACCACTTATGTTGTGGAGAGCCAAGGCCAAAAACTGGCCCTGCTGGGCGATCTGATTCTGGTTGCAGCCGTTCAGTTCGACGATCCGAGCGTGACCACACAGCTGGATAGCGACAGCAAAAGCGTGGCCGTGGAGCGCAAAAAAGCATTTGCCGATGCAGCCAAGGGCGGTTACCTGATTGCCGCAAGTCATCTGAGCTTTCCGGGTATCGGCCATATTCGTGCCGAAGGTAAAGGCTACCGCTTCGTGCCGGTGAACTACAGCGTGGTGAACCCGAAGCATCATCATCATCACCATTAA

引物，上游是：  ACCCACATGCACNNKGATCAT
           下游是：GATGTAGATTTCGTCCACCTGTTCC
PCR之后，序列对比发现多了100多个碱基，而且全是在突变位点附近。重复的序列包含了引物的上下游
测序结果：

GCGCAGCACCGCAGGTTCGCACCAGTGCACCGGGCTATTATCGTATGCTGCTGGGCGACTTTGAAATCACAGCCCTGAGCGATGGCACCGTGGCCCTGCCTGTGGATAAACGTCTGAATCAGCCTGCCCCGAAAACCCAGAGTGCCCTGGCCAAGTCTTTTCAGAAGGCACCGCTGGAGACCAGCGTGACCGGCTACCTGGTGAACACCGGCAGTAAGCTGGTTCTGGTGGACACCGGCGCAGCCGGTCTGTTCGGTCCGACACTGGGTCGCCTGGCAGCCAATCTGAAAGCCGCAGGCTATCAGCCGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCCCCACATGCACGATGATCATGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACGCTGATCATGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACGGTGATCATGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACCTGGATCATAGCCGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACCAGGATCATGTCAGGCTATCAGCCGGAACAGGTGGACGAAATCTACATCACCCACATGCACCCGGATCATGTGGGTGGCCTGATGGTGGGCGAACAGCTGGCATTTCCGAATGCAGTGGTTCGCGCCGATCAGAAAGAGGCCGATTTTTGGCTGAGCCAGACCAATCTGGATAAAGCCCCGGATGACGAGAGCAAGGGCTTTTTTAAGGGCGCTATGGCTAGCCTGAATCCGTACGTGAAAGCCGGCAAATTTAAACCGTTTAGTGGCAATACCGATCTGGTGCCGGGCATCAAAGCCCTGGCAAGCCACGGTCACACCCCGGGTCATACCACTTATGTTGTGGAGAGCCAAGGCCAAAAACTGGCCCTGCTGGGCGATCTGATTCTGGTTGCAGCCGTTCAGTTCGACGATCCGAGCGTGACCACACAGCTGGATAGCGACAGCAAAAGCGTGGCCGTGGAGCGCAAAAAAGCATTTGCCGATGCAGCCAAGGGCGGTTACCTGATTGCCGCAAGTCATCTGAGCTTTCCGGGTATCGGCCATATTCGTGCCGAAGGTAAAGGCTACCGCTTCGTGCCGGTGAACTACAGCGTGGTGAACCCGAAGCATCATCATCATCACCATTAA

BLAST 对比结果如图
想请问下，这是怎么回事呢？？？？？很不理解，老师也很不理解，说没遇到过。但是我和另一个做这个课题的同学都遇到了。求大神帮忙找找原因？



全质粒定点突变PCR,挑阳性克隆子测序，目的基因在突变点附近多了很多bp，求大神帮助
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全质粒定点突变PCR,挑阳性克隆子测序，目的基因在突变点附近多了很多bp，求大神帮助-1
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全质粒定点突变PCR,挑阳性克隆子测序，目的基因在突变点附近多了很多bp，求大神帮助-2
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1楼 2017-03-12 22:29:44
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
有没有感兴趣的大神，过来指导指导
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3楼2017-03-13 08:54:27
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
一只毛毛虫(金币+1): 谢谢参与
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-06 20:46:46
首先你的上游引物看起来就有问题，与模板结合片段很短，很可能出错。
另外pcr扩增整个质粒建议用的引物浓度低一点。
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4楼2017-03-13 09:33:23
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xuweitao at 2017-03-13 09:33:23
首先你的上游引物看起来就有问题，与模板结合片段很短，很可能出错。
另外pcr扩增整个质粒建议用的引物浓度低一点。

好的，谢谢指教
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5楼2017-03-13 15:48:28
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江边鸟

银虫 (小有名气)
★
一只毛毛虫(金币+1): 谢谢参与
把测序峰图发一份给我 我帮你看看 seq格式的文件  zhihongxu0713@hotmail.com

发自小木虫IOS客户端
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6楼2017-03-30 07:54:48
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
一只毛毛虫(金币+1): 谢谢参与
本帖仅楼主可见
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7楼2017-04-06 16:48:05
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薄荷西红柿

新虫 (初入文坛)
★
一只毛毛虫(金币+1): 谢谢参与
我刚刚做的点突变也是这样，很规整的在突变点后面重复上游引物序列四次，100碱基左右，我的体系是模板1，酶1，buffer 5，dNTP 5，引物2+2，，水34。你后来是怎么处理的，是引物引物加多了吗，谢谢。
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8楼2017-08-31 08:59:31
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HHHH0099

银虫 (小有名气)
★
一只毛毛虫(金币+1): 谢谢参与
楼主，你设计的引物我想请教一下NNK的话，互补链的引物是什么？
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9楼2018-04-27 11:59:52
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七琦绮弃

新虫 (初入文坛)
★
一只毛毛虫(金币+1): 谢谢参与
我也出现了同样的问题，请问楼主解决了吗？
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10楼2018-08-09 20:10:24
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syhorchid2楼
2017-03-12 22:47   回复  
一只毛毛虫(金币+1): 谢谢参与
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